서 론

사람에서 발병하는 치주질환은 Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, 그리고 Aggregatibacter actinomycetemcomitans와 같은 그람음성균 이 주요 원인균으로 작용한다[1,2]. 항생제 사용은 치주질환 의 일반적인 치료방법으로 흔하게 사용되는 치료법이다[3]. 항생제의 최소억제농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)는 세균의 증식을 억제하는 항생제의 최소농도를 의미 하는데, 이러한 항생제의 최소억제농도 이하의 농도 (sub-MIC)는 세균을 죽이거나 증식을 억제하지는 못하지만 다양한 미생물에서 형태적, 초 미세구조적 변화와 생화학적 특성, 부착특성을 포함한 여러 가지 특성에 영향을 미친다 는 것이 널리 알려져 있다[4].

몇 가지 연구에서 항생제의 sub-MIC가 세균에 미치는 여러 가지 영향 중, sub-MIC가 유도하는 형태변화 대한 연구가 다양한 종류의 세균에서 보고되었다. Souza 등의 연구에서 β-lactam계 항생제의 sub-MIC가 F. nucleatum 의 형태변화를 유도한다고 보고했고[5], Fonseca 등의 연 구에서 또한, P. aeruginosa에 β-lactam계 항생제의 sub- MIC농도로 처리했을 때, 세균의 형태가 변하는 것을 보 고하였다[6]. Silvestro 등의 연구에서는 Bacteroides fragilis가 clindamycin에 노출되었을 때, 일부 집단에서 세포의 길이가 늘어나는 것을 광학현미경으로 관찰하여 보고했다[7]. 이와 같이 sub-MIC 항생제가 세균에 미치 는 다양한 효과에 대한 연구가 많이 이루어져 있지만, sub-MIC 항생제가 구강 치주병원균에 형태적으로 미치 는 효과에 관한 연구는 아직 많지 않다.

본 연구에서는 여러 종류의 sub-MIC 항생제가 그람음 성 치주병원성 세균인 A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum 그리고 P. gingivalis에 형태적으로 어떠한 영 향을 미치는지 관찰하였다.

재료 및 방법

세균 및 배양조건

본 연구에서는 A. actinomycetemcomitans ATCC 33384, F. nucleatum ATCC 23726 그리고 P. gingivalis ATCC 33277를 사용하였다. 이 균주들은 조선대학교 치과대학의 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea)에서 무료로 분양을 받았다. 세균 배양을 위하여 A. actinomycetemcomitans는 Brain Heart Infusion (BHI) broth (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 액체배지를 사용하였고, F. nucleatum 과 P. gingivalis는 trypticase soy broth (Becton, Dickinson and Company)에 yeast extract (Becton, Dickinson and Company) 1 mg/ml, hemin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 5 µg/ml과 menadione (Sigma Chemicals Co.) 1 µg/ml을 첨가한 배지를 사용하였다. 모든 균주는 90% N₂, 5% CO₂, 5% H₂를 포함하는 혐기성 환경(Bactron Anaerobic Chamber, Sheldon Manufacturing Inc. Cornelius, Oregon, USA)에서 배양되었다. 세균 현탁액은 spectrophotometer (Smart Plus 2700; Young-woo inst., Seoul, Korea)를 사용하 여 탁도를 측정하였으며 미리 결정해놓은 표준곡선에 적 용하여 세균 수를 정량하였다.

항생제 최소 억제 농도(MIC)의 측정

실험 균주에 대한 항생제의 MIC는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)에서 권고하는 액체배 지 희석법으로 측정하였다[8]. 실험에 사용된 항생제는 치과 영역에서 사용되고 있는 amoxicillin, doxycycline, metronidazole, penicillin 그리고 tetracycline (Sigma Chemical Co.)을 사용하였고, 항생제의 stock 용액은 pore size가 0.22μm 필터(Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과 한 후 사용하였다. 최소억제농도(MIC)는 유리 시험관을 이용한 two-fold serial macro-dilution 법으로 측정하였다. 즉 혐기 성세균 배양기에 2일 이상 prereduce 시킨 배양 배지에 항 생제를 1/2 연속 희석한 후 세균을 5 x 105 cells/ml가 되게 접종하고 F. nucleatum과 P. gingivalis는 72시간, A. actinomycetemcomitans는 24시간 배양 후 육안으로 세균 성장이 억제된 최소항생제 농도를 측정하였다. 각 항생제 의 측정 농도 범위는 0.002 μg/ml에서 1024 µg/ml였다.

세균 형태 관찰

Sub-MIC 항생제가 세균 형태에 어떤 영향을 미치는 지 확인하기 위해 세균을 1/2 x MIC 또는 1/8 x MIC농 도의 항생제가 포함된 액체배지와 항생제가 포함되지 않은 액체배지에 F. nucleatum과 P. gingivalis는 72시간, A. actinomycetemcomitans는 24시간 배양하였다. 세균 배 양액은 phosphate-buffered saline (PBS)을 사용하여 원심 분리(14,000 xg)로 2회 세정하였다. 이렇게 얻은 세균 현 탁액을 slide glass에 도말하고 crystal violet으로 염색한 뒤, 광학현미경(NiKon, E400, Japan)을 사용하여 1,000 x 배율에서 관찰하였다. 세균의 크기는 Nikon NIS-Element software (DS-Fi2, Nikon)을 이용하여 측정하였으며, 각 세균의 길이는 광학현미경으로 관찰한 하나의 필드에서 각각 20개의 세균을 무작위로 선택하여 측정한 값의 평 균을 이용하여 길이 변화를 조사하였다.

통계 분석

각 항생제의 sub-MIC가 처리된 세균과, 처리가 되지 않은 세균의 전체적인 길이 차이를 통계학적으로 확인 하기 위하여 비모수적 방법인 Kruskal-Wallis 법을 사용 하였다(유의확률 p < 0.05). Mann-Whitney 법은 항생제 sub-MIC의 각 농도인 1/2 x MIC와 1/8 x MIC 농도에서 배양한 세균을 각각 아무런 처리를 하지 않은 세균과 비교했을 때, 각 sub-MIC농도의 항생제가 세균의 길이 에 어떤 영향을 미치는지 통계적으로 확인하기 위하여 수행하였다(유의확률 p < 0.05). 통계분석은 Software Package for Social Sciences (SPSS, version 20.0, IBM Inc., USA)를 사용하여 수행하였다.

결과

항생제의 MIC측정

A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum 그리고 P. gingivalis의 macro-dilution 법에 의해 측정한 MIC는 Table 1에 나타내었다. A. actinomycetemcomitans는 amoxicillin, doxycycline, penicillin, tetracycline에 대한 MIC보다 metronidazole에서 훨씬 높은 MIC값이 관찰되었다. 또한, amoxicillin과 penicillin의 MIC값은 다른 두 종인 F. nucleatum과 P. gingivalis보다 높게 관찰되었다. F. nucleatum에서 penicillin의 MIC값은 다른 항생제의 MIC값 보다 낮게 관찰되었다.

Sub-MIC 항생제가 세균형태에 미치는 영향

A. actinomycetemcomitans

광학현미경을 이용하여 각 항생제의 sub-MIC에서 배 양한 A. actinomycetemcomitans의 형태를 관찰한 결과 sub-MIC의 amoxicillin에서는 세균의 면적이 전체적으로 증가하는 것을 보여주었으며, sub-MIC의 penicillin과 metronidazole에서 배양된 세균의 길이가 늘어나는 것이 관찰되었다(Fig. 1). 이런 길이변화의 차이는 통계적으로 유의하게 확인되었다(p < 0.05). 그러나, doxycyline과 tetracycline에서는 어떠한 변화도 관찰할 수 없었다. Penicillin과 metronidazole는 모든 sub-MIC농도에서 A. actinomycetemcomitans의 길이가 항생제를 처리하지 않은 대조군에 비해 유의하게 길어지는 것을 확인하였다(p < 0.05). Amoxicillin은 1/2 x MIC에서만 항생제를 처리하지 않은 대조군에 비해 A. actinomycetemcomitans의 형태변화 에 유의한 차이를 나타내는 것을 확인하였다(p < 0.05).

F. nucleatum

광학현미경을 이용하여 각 항생제의 sub-MIC에서 배양 한 F. nucleatum의 형태를 관찰한 결과 amoxicillin, doxycycline, metronidazole, penicillin 그리고 tetracycline의 sub-MIC에서 세균의 길이 변화가 관찰되었다(Fig. 2). 이런 길이변화의 차이는 통계적으로 유의하게 확인되었다(p < 0.05). Sub-MIC농도의 amoxicillin, penicillin, metronidazole에 서 배양된 F. nucleatum은 세균의 길이가 늘어나는 것을 관 찰할 수 있었다. 그러나, doxycycline과 tetracycline의 sub-MIC는 세균의 길이를 감소시켰다. 또한, sub-MIC 항생 제가 유도하는 F. nucleatum의 형태변화는 sub-MIC 농도에 의존적 이었다. 세균의 길이변화는 세균이 항생제의 더 높 은 농도에서 배양될수록 명확하게 관찰되었다. 사용한 항생 제의 모든 sub-MIC농도에서 F. nucleatum 길이가 항생제를 처리하지 않은 대조군에 비해 유의하게 변화하는 것을 확인 하였다(p < 0.05).

P. gingivalis

각 항생제의 sub-MIC에서 배양한 P. gingivalis의 형태 를 관찰한 결과 sub-MIC의 penicillin과 metronidazole에서 배양된 세균의 길이가 길어지는 것이 관찰되었다(Fig. 3). 이런 길이변화의 차이는 통계적으로 유의하게 확인 되었다(p < 0.05). 그러나, amoxicillin, doxycycline 그리고 tetracycline에서는 어떠한 변화도 관찰할 수 없었다. 사 용한 metronidazole의 모든 sub-MIC농도에서 P. gingivalis 의 길이가 항생제를 처리하지 않은 대조군에 비해 통계 적으로 유의하게 길어지는 것을 확인하였다(p < 0.05). Penicillin은 1/2 x MIC에서만 항생제를 처리하지 않은 대조군에 비해 P. gingivalis의 길이가 통계적으로 유의 하게 길어지는 것을 확인하였다(p < 0.05).

고찰

항생제는 치태로부터 발생하는 대표적인 감염성 구강 질병 중 한가지인 치주질환의 치료를 위해 보조적으로 사용된다[9]. 항생제를 불규칙적으로 복용하는 것은 항 생제의 농도가 서서히 감소하여 sub-MIC에 도달하는 기 간을 유발하기 때문에 구강 세균에 대한 항생제 sub-MIC 효과에 관한 연구가 필요하다.

항생제의 sub-MIC는 세균의 증식을 억제하거나 죽이 지는 못하지만 세균의 병독성에 영향을 줄 수 있다고 알려져 있다[10]. 다양한 β-lactam계 항생제의 sub-MIC는 Escherichia coli에서 리보솜의 수와 분포를 포함한 세균 의 초 미세구조의 변화와, 세포벽의 형태변화 및 신장과 확장을 유도한다고 보고되는 등[11], 항생제의 sub-MIC 는 다양한 세균에서 형태 및 초미세구조에서의 변화, 생 화학적 특성의 변화와 부착능력에서의 변화 등을 포함 하는 여러 가지 효과를 나타낸다[4] 이러한 효과는 항생 제의 농도가 MIC나 Minimal Bactericidal Concentration (MBC)에 도달한 이후부터 특정한 시간 동안 주변조직 사이에서 발생하는 항생제-세균 상호작용의 변화를 야 기하기 때문에 치료적으로 중요한 의미를 지닐 수 있다. 항생제 sub-MIC의 여러 가지 효과 중 형태변화와 관련하여, 일부 항생제는 직간접적으로 세균의 단백질 합성과정을 변화시켜 그람음성 막대균의 길이를 길게 유도하거나 방추형의 형태를 유도한다고 알려져 있다[12]. Sub-MIC의 imipenem과 piperacillin/tazobactam을 사용하여 Pseudomonas aeruginosa종의 형태변화를 연구한 논문에서, imipenem은 1/2 x MIC에서 P. aeruginosa를 원래 모양보다 짧고 둥근 모양을 유도하였고, piperacillin/ tazobactam은 1/2 x MIC에서 P. aeruginosa의 길이가 길게 유도되는 것을 관찰하였다[6]. 또한, sub-MIC의 florfenicol[13]과 chloramphenicol[14]은 Staphylococcus aureus의 세포벽을 두껍게 유도한다고 보고되었다.

치주병원균인 F. nucleatum를 사용한 Souza 등의 이전 연 구에서 세균의 형태변화가 ampicillin, ampicillin-sulbactam 그리고 piperacillin-tazobactam를 포함하는 β-lactam계 항생 제에서 발생했으며, 이 항생제들이 세균의 길이를 길어지게 하고, 평균 세균 면적을 22배 이상 증가시키는 것을 관찰하 였다. 반면에, chloramphenicol, levofloxacin, metronidazole, clindamycin과 같은 항생제에서는 약간의 변화만이 관찰되 었다고 보고했다[5].

우리의 연구에서도 β-lactam계 항생제로 amoxicillin과 penicillin을 사용했지만, penicillin에서만 실험에 사용된 모 든 세균의 형태가 급격하게 변하는 것을 관찰하였다. Amoxicillin은 F. nucleatum 에서만 급격한 형태변화를 유도 했으며, A. actinomycetemcomitans에서는 세균의 두께를 약 간 증가시키는 것이 관찰되었다. 반면에, metronidazole에서 는 세 균주 모두에서 형태변화를 유도하는 것이 관찰되었 다. 결과적으로 실험에 사용 된 모든 항생제인 amoxicillin, doxycycline, metrionidazole, penicillin 그리고 tetracycline의 sub-MIC가 F. nucleatum의 형태변화를 유도하는 것을 관찰 하였고, A. actinomycetemcomitans는 amoxicillin, penicillin 그 리고 metronidazole의 sub-MIC에서 형태변화가 관찰되었으 며, P. gingivalis은 penicillin과 metronidazole의 sub-MIC에서 길이가 길어지는 것을 관찰하였다.

이렇게 항생제가 세균의 형태를 변화시키는 기작은 몇몇의 항생제에 대해서만 일부 알려져 있을 뿐이다. 그 중, imipenem이나, piperacillin/tazobactam과 같은 β-lactam 계 항생제들은 몇 가지 penicillin-binding proteins (PBPs) 에 친화도를 가지고 있어서 세포 표면에 변화를 유도하 며[15], chloramphenicol이나 florfenicol과 같은 항생제들 도 세균 세포벽 두께를 증가시키는 것은 이런 항생제가 단백질 합성 과정에서 세포벽을 구성하는 물질을 계속 해서 합성하도록 유도하기 때문으로 생각된다고 보고하 였다[14].

이러한 세균의 형태적 변화는 세균부착과 같은 병독 성에 영향을 미친다고 알려져 있다[16]. Fonseca 등은 piperacillin/tazobactam의 sub-MIC로 유도된 세포의 형태 변화가 고정상의 P. aeruginosa의 부착능력을 상당히 감 소시키는 것을 밝혔으며[17], 항생제의 sub-MIC가 세균 의 형태와 부착의 상관관계는 몇 가지 연구에서 관련성 이 있는 것으로 보고가 되었지만, 세균의 형태변화가 어 떻게 부착에 영향을 미치는지에 관한 구체적인 기전은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. Sub-MIC로 유도되는 세포벽 소수성의 변화나 단백질 생성의 변화 등 세균의 형태변화가 부착에 영향을 미치는 기전은 더 세밀한 추 가연구를 통하여 밝혀져야 할 것이다.

본 연구를 통하여, sub-MIC의 항생제가 다양한 양상 으로 치주질환 관련 세균의 형태학적 변화를 유도함을 보였으며, 이러한 형태변화가 세균의 병독력에 미치는 영향에 대한 추가 연구들은 선택적 항생제 치료에 대한 연구에 중요한 기반을 제공할 것이다.