서 론
사람 구강 내 세균은 치아, 치은, 타액선, 협점막 및 혀로 구성된 특수한 환경에서 서식하고 있으며, 16S ribosomal RNA 유전자(16S rDNA) 핵산염기서열비교 결 정법에 의해 약 500-1,200 여 종(또는 taxa)의 세균이 존 재하고, 이들 중 현재 배양된 세균 종은 약 380 종으로 알려져 있다[1-3]. 즉, 800 여 종은 아직 배양이 되지 않 은 상태이다. 이들 세균들은 숙주의 면역력 및 구강 위 생 상태에 따라 치아우식증, 치주질환, 치수 및 치근단 질환, 악골 골수염 등의 다양한 구강 질환의 주요한 병 인 인자이다[4-7]. 또한 구강 내 세균들은 치주질환에 의 한 치은조직 파괴에 의해 이차적으로 혈관을 통해 전신 으로 전이되어 동맥경화증, 심내막염을 포함하는 심혈관 질환, 당뇨병, 세균성 폐렴, 골수염, 유산 등과 같은 전 신 질환의 직접 혹은 간접적인 원인으로 작용하는 것으 로 알려졌다[8-12].
구강 내에 세균성 감염 질환의 치료 목적으로 항생제 가 임상에서 자주 사용되어지고 있다. 국내 대부분의 치 과병원에서는 항생제 처방을 목적으로 감염 병소에서 세균을 분리 배양하고 항생제 내성 검사를 하지 않고 경험적으로 항생제를 처방하는 경우가 대부분이다. 이러 한 이유로 항생제 오남용의 결과 항생제 내성을 갖는 세균들의 출현이 사회적 문제로 대두되고 있다[13,14]. 그러므로 치과 영역에서도 구강 감염성 질환의 치료를 목적으로 항생제를 처방하는 경우 항생제 감수성 검사 가 선행되어야 할 것으로 생각된다.
구강 내에 존재하는 세균 종은 인종과 지리학적 위치 에 따라 다르고, 균주에 따라 숙주의 구강 조직 세포에 대한 병원성의 차이가 있다[15,16]. 그러므로 한국인 구 강에 존재하는 임상균주의 구강 내 세균 분포와 다양한 세균 종의 생리학적 특성, 항생제 감수성 검사 및 세균- 숙주간의 상호작용 등의 연구가 필요하다. 본 연구에서 는 구강 내 세균 감염 병소에서 분리되어 종 수준으로 동정되지 않은 상태로 한국구강미생물자원은행(KCOM, Korean Collections of Oral Microbiology, Gwangju, Korea) 에 기탁된 균주들을 분양받아 16S rDNA 핵산염기서열 비교 분석법을 이용하여 동정하였다. 또한 유사한 구강 질환으로 내원한 환자의 항생제 처방에 대한 자료를 얻 고자 임상에서 빈번하게 사용되고 있는 8 종 항생제에 대한 감수성 검사를 시행하였다.
실험재료 및 방법
세균 및 세균 배양
본 연구에서 사용된 모든 균주들은 한국구강미생물자 원은행에서 분양 받아 사용하였다. 이들 균주들은 한국 인의 구강 내에서 호기성 배양 상태에서 분리되어 종 수준으로 동정 되지 않은 상태로 한국구강미생물자원은 행에 기탁된 것들이었다(Table 1).
이들 균주들은 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratory, Detroit, MI, U.S.A.)에 0.5% yeast extract, 0.05% cysteine HCl-H2O, 0.5 mg/ml hemin 및 2 μg/ml vitamin K1가 포함 된 배지에 접종하여, 37℃ 세균 배양기에서 배양하였다.
PCR 증폭물의 클로닝
세균의 지놈 DNA들은 CTAB method에 따라 추출하 였다[17]. 본 연구에서 분석하고자 하는 16S rDNA 유전 자를 PCR법으로 증폭하기 위해 27F (5'-AGA GTT TGA TC[A/C] TGG CTC AG-3') 및 1492R (5'-TAG GG[C/T] TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 프라이머들을 사용하였 다[18]. 이들 프라이머는 Bioneer 사(Daejeon, Korea)에 의 뢰하여 제작하였다. 이 때 PCR의 조건은 선행 논문에서 기술된 방법을 이용하였다[19]. 최종 반응물은 2 μl씩 1.5% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 그 증폭여부 를 확인하였다.
PCR 증폭물은 pGEM-T easy vector (Promega Co., Madison, WI, USA)에 클로닝하여 E.coli DH5α를 형질전 환시켰다. 재조합 플라스미드는 바이오니아 사의 AccuPrepTM Plasmid Extraction Kit를 이용하여 추출하였다.
핵산염기서열 결정
핵산염기서열 결정은 코스모진텍사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 결정하였다. 이때, 사용되는 프라이머는 ChDCGEM- F (5'-TTC CCA GTC ACG ACG TTG TAA AA-3') 와 ChDC-GEM-R (5'-GTG TGG AAT TGT GAG CGG ATA AC-3')이며, 그 결과는 SeqMan 프로그램(Version 7.00; DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 분 석하였다. 위에서 결정된 핵산염기서열은 EzTaxon 프로 그램(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)을 이용하여 상동성 검색을 하였고, 그 결과 98% 이상 상동성을 보이는 표준 균주의 종과 같은 종으로 판정하였다.
항생제 감수성 실험
Penicillin G (페니실린 G), amoxicillin (아목사실린), cefuroxime axetil (세프록심 아세틸), tetracycline (테트라 싸이클린), clindamycin (클린다마이신), oxacillin (옥사실 린), vancomycin (반코마이신, 그람 양성 세균에만 사용), polymyxin B (폴리마이신 B, 그람 음성 세균에만 사용) 는 Sigma 사(St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. 그람 음성 세균인 경우 반코마이신에 대한 내성이 높기 때문에 그람 음성세균에 대한 항균능이 높은 폴리마이 신 B를 사용하였다. Augmentin (amoxicillin + clavulanic acid, 5:1, 오그멘틴)은 일성제약주식회사(Seoul, Korea)의 것을 사용하였다. 여러 항생제에 대한 최소성장억제농도 (minimum inhibitory concentration; MIC)는 Murray와 Jorgensen의 방법[20]에 따라 액체배지 희석법으로 측정 하였다. 이를 간략히 설명하면, 각각의 항생제의 농도가 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.12, 0 μg/ml인 액 체배지 0.1 ml를 96-well plate well에 분주하였다. 여기 에 600 nm의 파장에 대한 흡광도가 0.05로 일정하게 현 탁된 세균배양액을 각각 0.1 ml씩 접종하였다. 그리고 항생제와 세균을 반응시킨 96-well plate는 37℃ 세균 배 양기에서 24시간 배양한 후, Microplate Autoreader (Model; EL311SX, BIO-TEX Instruments Inc., Cortland, NY, USA) 를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 세균을 접종하지 않은 배지의 흡광도 값과 비교하여 세 균이 자라지 않은 항생제 농도를 MIC 값으로 결정하였 다. 감수성 여부 농도는 Clinical and Laboratory Standards Institute [21]에서 권고한 해석 표준에 따랐다(Table 2).
결 과
구강 병소에서 분리된 세균 동정
한국구강미생물자원은행에서 분양받은 21명의 환자로 부터 분리된 77개 임상균주들의 16S rDNA를 클로닝하 여 핵산염기서열을 결정하여 GenBank에 등록하였으며, EzTaxon 프로그램을 이용하여 종 수준으로 동정하였다 (Table 3). 그 결과 그람 양성 세균은 55균주(71.4%), 그 람 음성 세균은 22균주(28.6%)로 확인되었다(Table 3). 그람 양성 세균들 중에서는 연쇄구균(49.4%)과 포도구균 (14.3%)들이, 그람 음성 세균들의 경우 Neisseria 속 균 주(10.4%) 및 Citrobacter 속 균주(9.1%)들이 주를 이루었 다(Table 3).
구강세균들의 수종 항생제에 대한 최소성장억제농도
본 연구에서 동정된 균주들의 8종 항생제에 대한 MIC 값은 Table 4와 Table 5에 정리하였다. 동정된 77 균주 중 같은 환자에서 분리된 균주들은 동일한 균주라 생각 되어 그들 중 한 균주만 항생제 내성검사를 실시하였다. 즉, KCOM 1664 (KCOM 1663과 동일), KCOM 1733, KCOM 1735, KCOM 1737 (이상 KCOM 1731과 동일), KCOM 1758 (KCOM 1756과 동일), KCOM 1761, KCOM 1762 (이상 KCOM 1759와 동일), KCOM 1874, KCOM 1879 (KCOM 1873과 동일) 균주들은 제외하였다. 또한 5 균주들(KCOM 1727, KCOM 1728, KCOM 1820, KCOM 1823, KCOM 1825)은 한천배지에서 자라나지만 액체배 지에서는 배양이 되지 않아 항생제 내성 검사에서 제외 하였다. 항생제 감수성 검사에는 그람 양성 세균 46 균 주와 그람 음성 세균 17 균주를 사용하였다. 그 결과 그 람 양성 세균 중 연쇄구균은 반코마이신에 100%, 세프록 심 아세틸에 89.7%, 클린다마이신에 79.3%의 균주가 감 수성을 보였다. 테트라사이클린은 62.1%로 내성이 가장 높은 항생제로 나타났다(Table 4). 그람 양성 세균 중 4균 주의 Staphylococcus aureus가 분리되었는데 4균주 중 1균 주(KCOM 1887)가 옥사실린에 내성을 나타냄으로써 MRSA (methicillin-resistant S. aureus)로 판정되었다(Table 4). 또한 포도구균은 페니실린에 100% 내성을 보였으며, 아목사실린에는 81.8% 균주가 내성을 보였고, 오그멘틴 에는 72.7%가 내성을 보여 페니실린 계 항생제에 높은 내성을 나타냈다. 그리고 클린다마이신, 반코마이신, 세 프록심 아세틸에는 각 각 90.9%, 81.8%, 63.6% 균주가 감수성을 나타내었으며, 테트라사이클린에는 63.6% 균주 가 감수성을, 36.4% 균주가 내성을 보였다(Table 4). 그람 음성 세균은 테트라사이클린에 94.1%, 폴리마이신 B에 64.7% 균주가 감수성을 보였고, 클린다마이신에 94.1%, 페니실린, 아목사실린, 오그멘틴에 각 각 52.9% 균주가 내성을 보였다. Neisseria oralis인 KCOM 1723 균주는 폴 리마이신 B를 제외한 항생제에 감수성을 보였고 Proteus vulgaris인 KCOM 1661는 모든 항생제에 대해 내성을 보 였다(Table 5).
고 찰
본 연구 결과, 21명의 한국인 구강으로부터 분리된 세균 77균주들의 16S rDNA 핵산염기서열 비교분석법을 통한 세균 종 수준으로 동정한 결과 Streptococcus 속 38균주, Staphylococcus 속 11균주, Neisseria 속 8균주, Citrobacter 속 7균주, Gemalla 속 3균주, Actinomyces 속 2균주, Micrococcus 속 2균주, Rothia 속 2균주, Burkholderia 속 2 균주, Proteus 속 1균주, 및 Klebsiella 속 1균주를 얻었다. 본 연구 결과 다양한 세균 종이 검출되었으나, 여러 구강 세균성 감염질환의 주요 병인체로 알려진 Porphyromonas gingivalis 등과 같은 혐기성 세균이 동정되지 않았다. 이는 본 연구에서 사용되었던 균주들이 호기성 조건에서 배양 되었던 균주들이었기 때문이다. 검출된 세균 중에 Actinomyces, Gemella, Neisseria 및 Rothia 속 균주는 구강 정상 세균총의 일종이지만 Gemella haemolysans은 심근내 막염, 내수막염, 골수염을 유발하고[22-25], Rothia dentocariosa는 심근내막염[26,27]을 유발하며, Actinomyces neuii와 Actinomyces naeslundii은 골수염[28,29]을 유발한다 고 보고되었다. 또한, P. vulgaris는 장내 세균으로 골수염 과 연관이 있다는 연구 보고가 있다[30]. 이러한 균주들은 악골골수염 등과 같은 일종의 기회감염성 구강질환에서 분리된 점을 고려한다면, 이들균주들은 각 질환의 발병 및 진행에 밀접한 관련이 있는 것으로 생각된다.
본 연구에서 높은 빈도로 검출된 연쇄구균은 정상 세균 총에 속하며 골수염과 직접적인 관련이 있다는 연구 결과 는 없다. 그러나 S. pneumoniae와 같은 mitis 군 연쇄구균은 이차적 감염으로 인해 심각한 전신질환을 일으키는 중요 병인체로 알려져 있다. 연쇄구균은 16S rDNA 핵산염기서 열을 기준으로 anginosus, mitis, mutans, salivalius, bovis, 및 pyogenis 군으로 나뉘는데[31] 본 연구에서는 anginosus, mitis, salivalius 군에 속하는 종이 검출되었다. Anginosus 군 연쇄구균에 속하는 Streptococcus constellatus와 Streptococcus intermedius 종은 16S rDNA 핵산염기서열 바탕으로는 구 별이 어려우나 Park 등[32]의 연구에서 사용된 PCR pimer 를 이용하여 두 종간의 구별을 할 수 있었다(data not shown). Mitis 군 연쇄구균은 임상균주의 16S rDNA 핵산염 기서열과 EzTaxon database의 핵산염기서열을 비교하여 상 동성이 가장 높은 결과로 균주의 종을 우선적으로 결정하 였다. 그 결과 Streptococcus mitis (1 균주), Streptococcus pseudopneumoniae (3균주), Streptococcus oralis (3균주), Streptococcus sanguinis (1균주), Streptococcus parasanguinis (3균주), Streptococcus australis (1균주), Streptococcus gordonii (1균주), Streptococcus sinensis (1균주), Streptococcus infantis (1균주), Streptococcus rubneri (1균주), Streptococcus dentisani (1균주)로 동정되었다. 하지만, 이들 mitis 군 연쇄 구균 균주들의 16S rDNA 핵산염기서열의 상동성이 99% 이상이기 때문에 향 후 연구에서 이들 균주들에 대한 재 동정의 필요성은 남아 있다고 생각된다.
한국인의 구강에서 분리 동정된 균주의 수종 항생제 감수성 검사 결과, 균주 대부분이 한 가지 항생제에 내 성을 갖기보다는 다양한 항생제에 내성을 갖고 있었다 (Table 4와 5). 이러한 결과는 본 연구에서 사용된 균주 들의 숙주인 환자들이 여러 항생제들에 노출된 경험이 많기 때문인 것으로 생각된다.
폴리펩타이드 계 항생물질은 세균의 세포막에 장애를 일으키는 물질로 그람 양성 세균과 그람 음성 세균에 작용하는 물질로 나뉜다. 반코마이신은 그람 양성 세균 에 작용하는 항생제로 본 연구결과에서는 연쇄구균과 포도구균이 반코마이신에 각 각 100%, 81.8% 감수성을 보여 이를 뒷받침 하였다. 이는 Bǎncescu 등[33]에 의한 연구와 일치하는 결과였다. 폴리마이신 B는 그람 음성 세균에 강력한 살균작용을 하는 항생제로 본 결과에서 도 대부분의 그람 음성 세균이 폴리마이신 B에 감수성 을 보였다. 페니실린 계 항생제는 β-lactam 고리를 갖고 있으며, 세포벽의 합성을 방해하여 살균작용을 일으킨다 [34]. 페니실린에 대한 내성은 내성균주가 β-lactam 구조 를 파괴시키는 β-lactamase의 유전자를 가지고 있어 항 생제의 효능이 없어지기 때문에 생기는 것이다[35]. 페 니실린은 일반적으로 연쇄구균, 포도구균에 효과적이며, 그 외에 다양한 그람 음성 세균에도 효과가 있는 것으 로 알려져 있으나, 시간이 지나면서 페니실린에 대한 내 성을 나타내는 세균들을 보고하는 연구가 증가하고 있 다[36,37]. 본 연구결과 포도구균, 그람 음성 세균 (Citrobacter braakii, Citrobacter freundii, Klebsiella sp., P. vulgaris)들이 페니실린 계 항생제에 내성을 갖고 있는 것으로 확인되었다(Table 4와 5). 이처럼 페니실린 내성 을 해결하기 위하여 β-lactamase 억제제인 clavulanic acid 가 개발되었는데 이 물질은 β-lactam 고리를 파괴시키는 β-lactamase와 결합하여 활성을 억제한다. 현재 β -lactamase를 생산해 내는 포도구균이나 그람 음성 세균 감염에는 페니실린 계 물질인 아목사실린과 clavulanic acid를 혼합하여 오그멘틴이라는 제품으로 개발되어 처 방되고 있다[38]. 그럼에도 본 연구 결과 오그멘틴에 내 성을 보이는 세균들이 있는데, 이는 β-lactamase 억제제 에 대한 β-lactamase의 결합력이 떨어져서 생긴 결과라 생각되지만[39]. 향 후 연구를 통해서 그 기전을 밝히고 자 한다. 리코사미드 계 항생물질인 클린다마이신은 50S ribosomal subunit에 결합함으로써 단백질 합성을 억 제하여 항균 작용을 나타낸다. 장내구균을 제외한 연쇄 구균, 포도구균 및 대부분의 혐기성 세균에 효과적이나 출혈성 대장염을 일으키는 경우가 있어서 페니실린 계 항생제에 알레르기가 있거나 내성이 있는 경우 제한적 으로 사용된다. 본 연구결과 장내세균을 제외한 연쇄구 균(79.3%)과 포도구균(90.9%)에 높은 감수성을 보였다.
테트라사이클린은 ribosomal의 30S 또는 50S unit에 작 용함으로써 단백질 합성을 억제하는 항생제로 사람이나, 동물, 양식장 등 광범위하게 사용되는 항생제이다 [40,41]. 본 연구결과 테트라사이클린에 내성을 갖는 균 주들이 다수 검출되었는데, 환경에 존재하는 대부분의 세균들이 테트라사이클린에 노출되고 있기 때문에 내성 을 갖게 될 확률이 높아진 것으로 생각해 볼 수 있다. 테트라사이클린에 대한 내성균주는 일반적으로 tetM 이 라는 내성 유전자를 가지고 있는데 Villedieu 등[42]의 연구에 따르면 내성 균주 종에 따라 tetM 이외의 다양 한 내성 유전자가 존재한다는 연구 결과가 있었다. 본 연구에서 테트라사이클린에 내성을 갖는 균주들은 향후 분자생물학적 방법을 이용하여 종에 따른 내성 유전자 에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다.
본 연구에서는 세균 배양법과 분자생물학적 분석을 통해 한국인 21명의 구강으로부터 분리된 세균을 동정 할 수 있었고, 이들의 본 연구에 사용한 8종 항생제에 대한 내성 유무를 확인할 수 있었다. 하지만, 구강에 존 재하는 세균종이 1,200 여 종이나 되기 때문에 본 연구 의 결과로 한국인에 존재하는 세균들의 항생제 내성에 대한 대표 자료라고 할 수 없다. 그러므로 향 후 연구를 통하여 더 많은 한국인 유래 구강 세균들을 분리 동정 하여 항생제 내성 검사를 실시한다면, 우리나라 국민들 의 구강 세균 감염성 질환의 치료에 항생제 내성 검사 전 항생제 처방의 기본 자료를 제공할 수 있을 것이라 생각된다.
