서 론

치아우식증은 치면세균막에 존재하는 세균들의 당질 대사에 의해 생성되는 젖산 등의 유기산에 의해 치아 표 면 무기질 탈회에 의해 발생하는 일종의 세균 감염성 질 환으로 알려져 있다[1]. 즉, 치아우식증의 여러 원인 인 자들 중에서 세균이 가장 중요한 원인 인자로 알려져 있 다. 현재 구강 내에는 700 여종의 세균이 존재하는 것으 로 알려져 있으며[2], 이들 중 Streptococcus sobrinus와 Streptococcus mutans 등이 사람의 치아우식증의 주요한 원인균인 것으로 알려져 있다[3].

현재까지 개발된 세균 검출법들 중 신속하면서 민감도 와 종-특이성이 뛰어난 방법이 실시간정량중합효소연쇄 반응(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR) 법이다. qPCR을 실시하기 위해서는 종-특이 프라이머 개 발이 필수적이다. 최근 본 연구자 팀은 DNA-dependent RNA polymerase beta-subunit 유전자 (rpoB)를 표적으로 하 여 S. sobrinus를 포함한 42 종 구강 세균에 대한 종-특이 qPCR 프라이머 쌍들을 소개하였다[4]. 그 연구에서 S. sobrinus ATCC 33478T를 포함한 75종 구강세균의 표준균 주들만을 이용하여 종-특이성을 검증하였다. 하지만, 후 속 연구를 진행하는 과정에서 S. sobrinus 종-특이 qPCR 프라이머 쌍(Ssob-F2/Ssob-R1)으로는 한국인에서 분리 동 정된 S. sobrinus 두 균주들(KCOM 1157 및 KCOM 1196) 의 지놈 DNA를 검출할 수 없음을 알게 되었다. 그러므로 본 연구는 rpoB를 표적으로 하는 새로운 S. sobrinus 종-특 이 qPCR 프라이머 쌍을 개발하고자 시행 되었다.

재료 및 방법

세균 및 세균 배양

본 연구에서 사용된 표준 균주들은 CCUG (Culture Collection, University of Göteborg, Sweden), KCTC (Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Korea), 및 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에 서 분양받아 사용하였다(Table 1). 또한 한국인 구강에서 유래된 S. sobrinus 임상균주들은 한국구강미생물자원은행 (Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea) 에서 분양받아 사용하였다.

Streptococcus spp., Enterococcus spp. 및 Neisseria spp. 균 주들은 brain heart infusion (BHI, BD diagnostics, Spark, MD, USA) 배지를 이용하여 37℃ 호기성 세균배양기 (Thermo Forma, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다. A.actinomycetemcomitans 균주들은 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratories)에 0.6% yeast extract, 5% horse serum, 75 μg/ml bacitracin 및 5 μg/ml vancomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 배지에서 배양하였다. 그 외 균주들 은 TSB에 0.05% cysteine HCl-H₂O, 0.5% yeast extract, 0.5 mg/ml hemin 및 2 μg/ml vitamin K1가 첨가된 배지를 이용 하여 혐기성 조건(85% N₂, 10% CO₂, 5% H₂) 하에 37℃ 혐 기성 세균배양기(Bactron I, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 배양하였다.

qPCR 프라이머 설계

S. sobrinus의 rpoB 핵산염기서열(GenBank accession no. AOCE01000060; 7,300..10,885 nts)을 바탕으로 PrimerSelect 프로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 qPCR 프라이머를 설계하였으며, 이들의 핵산염기서열은 다음과 같다. RTSsob-F4, 5′-CTA GTC CGG GCT CTT GGC TTC TCT-3′; RTSsob-R4, 5′-GCT TCA TCA GTT CTG GCA TCC GCA-3′. 이들 프라이머 쌍을 이용한 qPCR PCR 증폭물의 크기는 128 bp이며, 이들 프라이머 쌍은 Bioneer 사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.

qPCR 프라이머의 종-특이성 검증

본 연구에 사용된 세균들의 지놈 DNA들은 CTAB 방법 에 따라 추출하였다[5].

본 연구에서 설계된 qPCR 프라이머 쌍(RTSsob-F4/ RTSsob-R4)의 S. sobrinus에 대한 종-특이성은 일반적인 PCR법을 이용하여 검증하였다. PCR은 AccuPower® PCR PreMix (Bioneer) 및 MyGenie^TM 96 Gradient Thermal Block (Bioneer)을 이용하여 제조회사에서 제시해준 방법으로 실시하였다. RTSsob-F4/RTSsob-R4 프라이머들은 PCR 반 응 용액에 각각 최종 1 pmole/μl 농도가 되도록 넣었으며, 종-특이성을 알아보기 위해 사용된 세균 지놈 DNA들은 각각 4 ng 씩을 넣어서 반응을 시켰다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 10분간 전변성 처리, 95℃에서 10초간 변성 처리, 70℃에서 30초간 결합과 중합 과정을 30회 시행하고, 72℃에서 5분간 최종 중합과정을 시행하 였다. PCR 시행 후, 5 μl PCR 반응물을 1.5% 아가로스 젤을 매질로 하고, 1 X Tris-acetate buffer (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA, [pH8.0])를 전해질로 사용하여 100V에서 15분간 전기영동 하였다. PCR 증폭물들은 GoodView^TM Nucleic Acid Stain (SBS Greetech, Beijing, China)을 이용하 여 염색한 후, UV transilluminator로 확인하였다.

qPCR 프라이머의 민감도 특정

본 연구에서 설계된 RTSsob-F4/RTSsob-R4 프라이머 쌍 의 민감도를 측정하기 위한 qPCR은 TOPreal^TM qPCR 2X PreMIX (SYBR Green) kit (Enzynommics, Daejeon, Korea)와 및 Exicycler^TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (Bioneer)을 이용하여 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다 음과 같다. 2X qPCR PreMix에 RTSsob-F4/RTSsob-R4 프라 이머 쌍 각각 60 pmoles, S. sobrinus ATCC 33478^T 지놈 DNA를 20 ng에서 2 fg까지 10배씩 희석하여, 각각의 qPCR tube에 넣고, 최종 반응물이 50 μl가 되도록 double deionized water (DDW)를 첨가한 후 가볍게 교반하고, 1,500 x g에서 10초간 원심분리 하였다. qPCR 조건은 95℃에서 10분간 전 변성 과정을 거친 후 95℃에서 10초간 변성, 70℃에서 30초 간 결합과 중합 과정을 40회 반복하였으며, 60~94℃에서 1℃씩 1초간 스캔하여 melting curve를 분석하였다.

결과

본 연구에서 S. sobrinus를 검출하기 위해 설계된 qPCR 프라이머(RTSsob-F4/RTSsob-R4)의 종-특이성을 일반적인 PCR법으로 조사한 결과, S. sobrinus 표준균주 및 11주의 임상균주들의 지놈 DNA에서만 128 bp의 PCR 증폭물이 확인되었으며, S. sobrinus 이외의 구강 세균 52종(52 균 주)에서는 PCR 증폭물이 확인되지 않았다(Fig. 1).

본 연구에서 설계된 RTSsob-F4/RTSsob-R4 프라이머 쌍 들의 최소검출한도(민감도)를 측정하기 위해 S. sobrinus ATCC 33478T 지놈 DNA를 40 ng부터 4 fg까지 10배씩 순 차적으로 희석하여 qPCR을 수행하였다. 그 결과 RTSsob- F4/RTSsob-R4 프라이머 쌍은 S. sobrinus ATCC 33478T 지 놈 DNA 2 fg까지 검출할 수 있음을 확인하였다(Table 2 및 Fig. 2A와 2B).

Melting curve 분석을 실시하여 RTSsob-F4/RTSsob-R4 프라이머 쌍에 의한 비특이적 PCR 산물 유무를 검증한 결과, 단일한 패턴의 melting curve가 보여 비특이적 qPCR 산물이 보이지 않음을 확인하였다(Fig. 2C).

고 찰

본 연구 결과 S. sobrinus 종-특이 qPCR 프라이머 쌍 (RTSsob-F4/RTSsob-R4)은 표준균주인 S. sobrinus ATCC 33478^T 지놈 DNA를 4 fg까지 검출할 수 있었다(Fig. 2). 최근에 지놈 핵산염기서열이 결정된 S. sobrinus ATCC 33478^T 지놈 DNA가 약 2.14 Mb (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/JMLC00000000.1, GenBank accession no. NZ_JMLC 01000000)인 점을 고려한다면, RTSsob-F4/RTSsob-R4 프 라이머 쌍은 qPCR법에 의해 S. sobrinus를 최소 1.7 마리 에 해당하는 지놈 DNA까지도 검출할 수 있는 높은 민감 도를 보였다. 또한, RTSsob-F4/RTSsob-R4 프라이머 쌍은 한국인에서 분리 동정된 11 균주 S. sobrinus들을 종-특이 적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다(Table 2 & Fig. 1).

본 연구자 팀의 경험에 의하면, PrimerSeclect (DNASTAR Inc.)를 사용하여 설계된 프라이머 쌍들의 프로그램에서 제시하는 최적결합온도(optimal annealing temperature)는 실제와는 다른 경우가 많았다[6,7]. 본 연구에서도 Primer Seclect (DNASTAR Inc.)에서 제시한 RTSsob-F4/RTSsob-R4 의 최적결합온도는 54.4℃이었지만, gradient PCR를 실시 하여 얻은 실제 최적결합온도는 70℃이었다(데이터는 제 시하지 않음). 즉, S. sobrinus와 유전자 수준에서 상동성 이 가까운 S. mutans ATCC 25175^T 균주와 S. sobrinus ATCC 25611^T의 지놈 DNA를 이용하여 결합온도를 61-7 2℃ 사이에서 1℃ 간격으로 gradient PCR을 실시한 결과, S. sobrinus ATCC 25611^T의 지놈 DNA만 검출되고, S. mutans ATCC 25175^T의 지놈 DNA는 검출이 되지 않는 온도 중 PCR 증폭물 밴드의 진한 정도가 동일한 최고의 온도가 70℃이었다. 이러한 결과들을 고려하면, 세균 종- 특이 qPCR 프라이머의 최적 결합온도를 정할 때에는 단 순히 프라이머 설계용 프로그램에서 계산된 결합온도를 사용하기보다는 표적이 되는 세균종과 상동성이 높은 균 종의 균주 지놈 DNA를 이용한 gradient PCR을 실시한 후 에 결정하는 것이 최적의 결합온도를 정해야 한다는 것을 시사한다.

최 등[8]은 glycosyltransferase U gene (gftU) 염기서열을 표적으로 하는 S. sobrinus 종-특이 qPCR 프라이머 쌍을 소 개하였다. 그 연구에서 소개된 qPCR 프라이머 쌍도 SYBR Green 법을 이용하는 것이었다. 그들 qPCR 프라이머 쌍의 종-특이성은 10 종(10 균주)만을 대상으로 실시되었다. 또 한, 40 cycles의 qPCR을 실행하여 민감도를 측정하였지만, 실제 결과는 1 × 10⁴ CFU에 해당하는 S. sobrinus 세균에 해당하는 C_T 값(약 27)까지만 그래프로 보여주었다. 본 연 구에서 개발된 RTSsob-F4/RTSsob-R4 프라이머 쌍은 28.06 cycle에서 S. sobrinus 세균 170마리를 검출할 수 있는 민감 도를 가졌다는 점에서 최 등[8]이 개발한 S. sobrinus 종-특 이 qPCR 프라이머 쌍보다는 민감도가 더 뛰어남을 알 수 있었다.

qPCR 프라이머 쌍을 개발하기 위해서는 표적 유전자 가 필요하다. 세균 분류학적 측면에서 기준이 되는 유전 자는 16S rRNA 유전자(16S rDNA)로 이를 표적으로 하여 많은 세균 종-특이 qPCR 프라이머 쌍이 개발되고 있다 [9,10]. 하지만, 경우에 따라서 세균 종간에 16S rDNA 핵 산염기서열 상동성이 너무 높아서 qPCR 개발이 어려운 경우가 있다[11]. 이러한 16S rDNA의 단점을 보완하기 위 해 rpoB 핵산염기서열을 이용하여 세균 종-특이 qPCR 프 라이머를 개발하고 있다[4,6]. 즉, rpoB는 16S rDNA처럼 핵산염기서열 내에 모든 세균 종에서 상동성이 잘 보존된 부분과 종간에 상이성이 큰 부분이 있어서 상이성을 보이 는 부분에서 세균 종-특이 qPCR 프라이머 쌍을 설계하기 에 용이하다[12].

이상의 연구 결과를 종합하면, 본 연구에서 rpoB 핵산 염기서열을 바탕으로 설계된 qPCR 프라이머 쌍(RTSsob-F4/ RTSsob-R4)은 S. sobrinus를 높은 종-특이성 및 균주 1.7 마 리까지 검출이 가능한 뛰어난 민감도를 갖는다는 것이 확 인되었으며, 향후 치아우식증 분자역학 연구에 있어서 S. sobrinus을 검출하는 데 사용할 수 있을 것으로 생각된다.