서 론
치수(dental pulp)는 혈관 분포가 많은 조직이며, 견고 하고 팽창할 수 없는 벽에 둘러싸여 있다[1,2]. 최근에는 치수가 뛰어난 재생력을 가지는 것으로 보고되고 있다 [3]. 치수 절단술 이후, 치수의 치유 과정은 수복상아질 의 생성뿐만 아니라 혈관신생을 필요로 한다[4]. 혈관신 생은 이미 존재하는 혈관에서 새로운 모세혈관이 생성되 는 현상으로써 생리적으로는 배아발생, 상처치유, 조직재 생에 중요한 역할을 한다[5]. 혈관신생은 vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), thrombospondin-1 등과 같은 다양한 혈관신생 촉 진인자들 및 혈관신생 억제인자들에 의해 활발히 조절된 다고 알려져 있다[5]. 다양한 혈관신생 인자들 중 대표적 혈관신생 촉진인자로 알려진 VEGF 는 건강한 상태와 염 증 상태의 치수세포에서 발현되며 분비되고 있다고 알려 져 있다[6]. 또한 재조합 VEGF 와 bFGF 단백질이 치수 의 미세혈관 밀도를 높여서 상처 난 치수의 혈관재생을 촉진 시킬 수 있다고 보고되었다[7].
저산소 상태(hypoxia)는 혈관신생을 유도하는 대표적 인 생체 내 신호로, VEGF를 포함한 여러 혈관신생 인 자들의 발현을 유도한다고 알려져 있다[8]. 단단한 조직 에 둘러싸인 치수는 상처에 민감하며, 이러한 상처로 인 한 내압의 증가는 저산소 상태를 일으키기도 한다[9]. 뿐만 아니라 수복과정에서 사용되는 치과용 국소마취제 는 혈관 수축을 유도하여 치수 혈류를 감소시켜, 치수에 서 국소적인 저산소 상태가 관찰된다고도 알려져 있다[4]. 상처로부터 치수를 보호하기 위해 치수는 저산소 상태에서 생리적 반응을 보이는 동시에 병리적으로도 반응하게 된다. 저산소 상태가 치수세포의 세포주기 진 행 차단 및 세포사멸을 유도하기도 하고, 반면에 치수줄 기세포의 증식과 분화를 증가시키며 치수세포의 광화 작용(mineralization)을 촉진시키기도 한다[10,11,12]. 최근에 는 저산소 상태가 치수세포의 혈관신생 잠재력을 촉진 시킨다는 사실이 보고되고 있다[13].
본 연구에서는 angiogenesis proteome profiler array를 이용하여 치수세포에서 발현되는 혈관신생 인자들을 검 색하고 저산소 상태에서 발현이 달라지는 혈관신생 인 자들을 동정하였다. 발현이 달라지는 혈관신생 인자들 중 CXCL16의 발현이 저산소 상태에 의해 조절되는지 확인하였으며, 저산소 상태가 유도하는 혈관신생 효능에 CXCL16 단백질이 관여하고 있는 지를 검증하였다.
실험재료 및 방법
실험재료
사람의 치수세포(human dental pulp cells)는 일본 Hiroshima 대학의 Takashi Takata 박사 연구실에서 분양 받 아 사용하였다. 치수세포는 10% FBS (Fetal Bovine Serum) 과 penicillin G (10 units/ml), streptomycin (10 mg/ml)이 첨 가된 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였으 며, 3-5일마다 계대 배양하며 유지하였다[14]. 사람의 혈 관내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 는 CLONECTICS (Lonza, USA)에서 구매하여 5-8세대 사 이의 세포를 실험에 사용하였다. 0.2% gelatin이 도말된 세포 배양 접시에 10% FBS가 함유된 EGM-2 (CLONTECTICS) 성장 배지를 사용하여 배양하였다.
Proteome Profiler Human Angiogenesis Array Kit와 CXCL16 중화항체(neutralizing antibody)는 R&D systems 로부터 구입하였다. L-Mimosine과 dimethyloxaloylglycine (DMOG)는 Sigma Aldrich (USA) 제품을 사용하였다. Growth factor-reduced Matrigel은 BD Biosciences (USA) 에서 구 매하였다.
저산소 상태 (In vitro hypoxia)
저산소 상태를 만들기 위해 치수세포는 다중가스배양 장치(Anaerobic System Model 1024, Forma Scientific)에서 1% 산소농도로, 표기된 시간만큼 배양하였다. 다중가스 배양장치는 37℃, 95% N2/ 5% CO2 조건을 유지하였다. 이러한 상태는 치수세포의 생존에는 영향을 주지 않음 을 확인하였다. 이러한 조건은 일반적으로 저산소 상태가 유도하는 혈관신생 및 재생연구에 널리 사용되는 조 건이며, 최근 이와 같은 조건에서 치수세포의 혈관신생 잠재력이 증가된다는 사실이 보고된 바 있다[13].
Proteome Profiler Human Angiogenesis Array
치수세포는 차가운 PBS로 3회 세척 후, 세포용해액 (40 mM Tris–Cl, 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, 0.1% NP-40 및 protease inhibitor cocktail (Sigma Aldrich, USA))으로 용해 시켰다. 각 단백질의 양은 BCA (Sigma Aldrich, USA) 정량 법을 통해 확인하였다. 각 단백질액 (800 μg)은 detection 항체와 잘 섞어준 후, capture 항체가 붙어 있는 membrane 과 반응시켰다. 세척 후, Streptavidin-HRP과 실온에서 반 응시키고, 화학발광제 (ECL: Amersham PharmaciaBiotech) 를 반응시킨 후 X-선 필름 현상으로 단백질 발현을 확인 하였다. 각 반점의 발광 정도는 Image Gauge V4.0 (Fuji film)를 이용하여 수치화하였다. 현상한 X-선 필름을 스캔 하여 각 반점들의 픽셀을 측정하였다.
RNA 분리와 중합효소연쇄반응 (PCR)
치수세포에서 Total RNA를 추출하기 위해 TRIzol reagent kit (Invitrogen)를 사용하였다. Reverse transcription kit (Promega, USA)를 사용하여 2μg의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 β-actin (sense: 5′-GACTACC TCATGAAGATC-3′, antisense: 5′-GATCCACATCTGCTGGAA -3′), Angiogenin (sense: 5′-TGGGCGTTTTGTTGTTGGTCTTC -3′, antisense: 5′-CGTTTCTGAACCCCGCTGTGG-3′), CXCL16 (sense: 5′-CTGACTCAGCCAGGCAATGG-3′, antisense: 5′ -TGAGTGGACTGCAAGGTGGA-3′), Pentraxin3 (sense: 5′ -GCTGGAGAACTCGCAGATGA-3′, antisense: 5′-CCCAAAT GCAGGCACTAAAA-3′), Coagulation factor III (sense: 5′ -GACAATTTTGGAGTGGGAACCC-3′, antisense: 5′-CACTTTT GTTCCCACCTG-3′)의 primer를 이용하여 역전사중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 시행하였다. Real-time PCR은 power SYBR Green (Applied Biosystems, USA) 시약을 사용하였 으며, 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) 기기를 사용하여 실시하였다. 각각의 primer는 다음 과 같다. β-actin (sense: 5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′, antisense: 5′-TGTTGGCGTACAGGT CTTTG-3′), Angiogenin (sense: 5′-GGGCGTTTTGTTGTTGGTCT-3′, antisense: 5′-GC GCTTGTTGCCATGAATAA-3′), CXCL16 (sense: 5′-GGCAGC GTCACTGGAAGTTGTTAT-3′, antisense: 5′-ACCGATGGTAA GCTCTCAGGTGTT-3′), Pentraxin3 (sense: 5′-GTGCTCTCTGG TCT GCAGTG-3′, antisense: 5′-GTCGTCCGTGGCTTGCAG- 3′), Coagulation factor III (sense: 5′-TCCCGAACAG TTAACC GGAA-3′, antisense: 5′-GACCACAAATACCACAGCTCCA-3′).
관형성 실험 (Tube Formation Assay)
Growth factor-reduced Matrigel (300 μL)을 24-well plate 에 넣어서 1시간 동안 37℃에서 gel 상태로 굳혀준다. 1.5X105개의 혈관내피세포를 250 μL의 신선한 혈관내피 세포 배지에 준비한다. 여기에 250 μL의 치수세포 배양 액을 섞어준다. 치수세포 배양액은 정상 상태와 저산소 상태에서 8시간 동안 배양 후 얻은 세포배양액을 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 불필요한 찌꺼기를 제 거한 상층액을 사용하였다. 전체 500 μL의 정맥내피 세 포가 들어있는 배지를 굳은 gel 표면에 얹어준다. 이후 6시간 동안 37℃ 배양기에서 관이 형성되도록 반응시킨 다. 세포의 형태적인 변화를 현미경으로 관찰하면서 사 진을 찍어둔다. 실험군과 대조군의 관형성 정도 차이를 세어 수치화 한다.
RNA interference
치수세포에 OligofectamineTM (Life Technologies)을 이 용하여 HIF-1α의 발현을 선택적으로 저해 할 수 있는 siRNA (antisense: 5´-UCAAACACACUGUGUCCAG-3´; sense: 5´-CUGGACACAGUGUGUUUGA-3´) (100 nM)를 형질주 입 (transient transfection)하였다. HIF-1α siRNA와 control siRNA는 각각 Samchuli Pharm (Korea)와 Bioneer (Korea) 에서 구입하였다. 24시간 형질주입 후, 치수세포는 정상 상태와 저산소 상태에서 표시된 시간만큼 배양하였다.
결 과
치수세포에서 혈관신생 관련 단백질의 발현 분석
사람의 치수세포에서 발현되는 혈관신생과 관련되어 있는 “secretome” 단백질들을 조사하기 위해, 55개의 혈 관신생촉진인자 및 억제인자들의 단백질 발현을 분석할 수 있는 Proteome profiler human angiogenesis array를 실 시하였다. X-선 필름을 이용하여 각 단백질의 발현을 확인하였고, 이를 이미지 프로그램을 이용하여 각 반점 들의 크기를 수치화하였다(그림 1A와 1B). 55개의 단백 질 중 Coagulation factor III, Endoglin, Fibroblast growth factors (FGFs), Insulin-like growth factor-binding protein (IGFBP)-3, Serpin E1, Tissue inhibitor of metalloroteinase (TIMP)-1 및 Thrombospondin-1 단백질들이 높은 수준으 로 발현되어 있음을 확인하였다.
정상 상태와 저산소 상태에서 치수세포 내 혈관신생 관련 단백질의 발현 패턴
치수세포는 상아질이라는 경조직에 둘러싸여 있으며, 생리적 또는 병리적으로 산소가 부족한 환경에 노출 되 어있는 경우가 많다. 따라서 저산소 상태에서 혈관신생 관련 단백질들의 발현을 조사하였다. 치수세포를 정상 상태(21% O2)와 저산소 상태(1% O2)로 16시간 동안 배양 하여 치수세포에서 단백질을 각각 분리하였다. 각 단백 질을 Proteome profiler human angiogenesis array kit를 이 용하여 혈관신생 관련 단백질들의 발현 차이를 확인하였 다. 정상 상태와 비교하여 저산소 상태일 경우, 55개의 단백질 중 14개의 단백질이 다른 발현 양상을 보였다(그 림 2A와 2B). 그 중 저산소 상태에서 증가 양상을 보이 는 Angiogenin, Coagulation factor Ⅲ, CXCL16, 및 Pentraxin3 단백질의 발현 차이를 유전자 수준에서 직접 확인하기 위하여 각각의 primer를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다(그림 3A). 그림 3A에서 보는 바와 같이 각 유전자 모두 8시간 또는 16시간 동안 저산소 상태에 노 출 된 경우 정상 산소 상태일 때와 비교하여 발현이 증 가됨을 확인 할 수 있었다. 뿐만 아니라 각각의 유전자 들의 양적인 발현 차이를 비교하고자 Real-time PCR을 수행하였다. 그림 3B와 같이 actin의 발현양에 대해 상대적인 발현차이를 비교하였을 때 Angiogenin, CXCL16 및 Pentraxin3의 경우 8시간에서, Coagulation factor Ⅲ는 16 시간에서부터 눈에 띄는 발현차이를 보였다. CXCL16의 경우 8시간 저산소 상태에서 증가하던 유전자 발현이 16 시간에 이르자 감소하는 현상을 나타냈다. 4개의 유전자 모두 RT-PCR과 Real-time PCR을 통해 저산소 상태에서 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한 저산소 상 태와 유사한 환경을 조성하는 L-Mimosine 또는 DMOG를 처리하여 Angiogenin, Coagulation factor Ⅲ, CXCL16 및 Pentraxin3의 발현차이를 확인하고자 하였다. Hypoxiainducible factor-1α (HIF-1α)는 저산소 상태에서 여러 가지 유전자들의 발현을 활성화시키는 대표적인 전사인자이 다[15]. L-Mimosine과 DMOG은 prolyl hydroxylase domain protein의 작용을 방해함으로써 HIF-1α 단백질의 분해를 억제하여 HIF-1α 단백질 발현을 증가시키는 물질들이다 [16]. 그림 3C에서 보이는 바와 같이 정상 상태에 비해 저산소 환경 뿐만 아니라 L-Mimosine과 DMOG를 처리한 경우, Angiogenin, Coagulation factor Ⅲ, CXCL16 및 Pentraxin3의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다.
저산소 상태에서 증가되는 혈관신생 관련 단백질이 혈관내피세포의 관형성에 미치는 영향
저산소 상태에서 혈관신생 관련 단백질이 증가함을 확 인하였고, 실제 이러한 단백질이 혈관신생에 미치는 영향 을 확인하고자 사람의 혈관내피세포(HUVECs)을 이용하 여 관형성 실험을 실시하였다. 먼저 저산소 상태에서 증 가되는 대표적인 혈관신생 조절 전사인자인 HIF-1α가 미 치는 영향을 확인하고자 치수세포에 HIF-1α siRNA를 형 질 주입하여 HIF-1α의 발현을 저해시켰다. 그림 4A에서 보는 바와 같이 정상 상태의 치수세포의 배양액과 저산소 상태의 치수세포 배양액을 이용하여 혈관내피세포의 관 형성능을 비교하였을 때 저산소 상태의 배양액을 처리한 실험군에서 관형성이 증가 함을 확인하였다. 그러나 HIF-1α의 발현을 억제한 치수세포를 저산소 상태에서 배 양한 실험군에서는 혈관내피세포 관형성능이 감소하는 효과가 나타났다. CXCR6의 리간드인 CXCL16은 다양한 세포들에서 막단백질 형태 및 분비성 단백질로 존재한다. 이러한 CXCL16이 앞서 저산소 상태의 치수세포에서 발 현이 증가되어 있음을 확인하였다. 치수세포 배양액에 CXCL16 단백질의 기능을 억제 할 수 있는 중화 항체 (neutralizing antibody)를 함께 처리한 경우, 저산소 상태의 치수세포 배양액에 의해 증가되었던 혈관내피세포의 관 형성 효과가 억제됨을 확인하였다(그림 4B). 이는 저산소 상태에서 증가된 HIF-1α와 CXCL16이 치수세포 배양액이 유도하는 혈관신생에 중요한 역할을 함을 보여준다.
고 찰
치수는 단단한 상아질 벽 내 위치한 느슨한 결합조직 으로 세포, 섬유질, 혈관, 신경을 함유하고 있다. 치수조 직은 치아보호, 영양공급, 수복을 포함한 치아 생명력을 위한 여러 기능을 수행한다[17]. 치수에서 혈관신생은 상처 또는 염증 이후에 치수의 재생과정에 중요한 과정 으로 작용한다[18]. 본 연구를 통해 치수세포는 다양한 혈관신생 촉진인자들 및 억제인자들을 발현하고 있으며, 저산소 상태에서 정상 상태와 다르게 발현되는 혈관신 생 인자들을 관찰하였다.
건강한 치수 및 염증성 치수조직에서 유래된 치수섬 유아세포가 VEGF를 발현한다고 보고되었다[6]. VEGF 는 생리적, 병리적 혈관신생의 중요한 조절자이며, 혈관 신생을 위한 혈관내피세포의 증식, 이동, 생존 및 관형 성을 유도한다[19]. 특히 최근에는 재조합 VEGF가 면역 이 결핍된 생쥐에 식립된 치아 슬라이스에서 혈관신생 을 유도한다는 사실이 보고되었다[7,20]. 또한 접착 레진, lipoteichoic acid과 같은 여러 가지 외부요인에 의해 서도 치수에서 VEGF의 발현이 유도된다고 알려져 있다 [21]. 본 연구에서 동정된, 치수에서 발현되고 있는 혈관 신생 인자들이 치수에서 생리적, 병리적 다양한 현상에 어떠한 역할을 하는지, 그리고 어떠한 세포 내 신호에 의해 발현이 되고 있는지는 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
치수는 높은 재생능을 가지는 것으로 보고되고 있다. 치수는 혈관이 풍부한 조직으로 와동 형성시 치수조직 에 상처가 나면 그 내부의 상처 입은 혈관내피세포는 여러 분자들을 분비시켜 염증반응 및 치유과정을 동시 에 진행시키게 된다[4]. 치수절단술 이후에도 상처에 반 응하여 치수전구세포는 활성화되고 혈관내피세포가 이 동되는 것으로 알려져 있다[22]. 많은 보고들에서는 수 복상아질 형성과정에서 법랑질과 상아질에서 분비되는 성장인자들 및 신호기전 연구에 대해서 집중되어 왔다 [23]. 그러나 치수절단술 이후에 완전한 치수 치유를 위 해서는 수복상아질의 생성뿐만 아니라 혈관신생 및 신 경섬유의 재생도 필요로 한다는 사실이 부각되면서 치 수에서의 혈관신생에 대한 연구가 최근 활발히 이루어 지고 있다[6].
저산소 상태는 여러 가지 세포에 세포이동, 대사조절, 세포사멸, 혈관신생과 같은 다양한 생리적 반응을 초래 하게 한다[24]. 또한 최근에는 저산소 상태가 세포분화, 전구세포의 증식능, 생존능을 높인다고 보고되고 있다 [25]. 치수세포에서는 저산소 상태가 전구세포의 수를 증폭시키고 혈관신생능 및 상아모세포의 분화능을 높여 효율적인 치료를 유도한다고 in vitro 연구를 통해 알려 져 있다[11,12,13]. 하지만 in vivo에서 저산소 상태가 치수 세포에 직접적인 손상 없이 여러 가지 생리적 현상들을 유발시킬 수 있는지에 대해서 향후 다양한 연구를 통해 증명해야 할 것으로 판단된다.
본 연구에서는 저산소 상태가 치수세포에서 CXCL16 를 포함한 여러 혈관신생 인자들의 발현을 높이고 있음 을 증명하였다. CXCL16은 케모카인 수용체 CXCR6의 리간드로써, 분비성 단백질 형태뿐만 아니라 막단백질 형태로도 존재한다. CXCL16은 대식세포, 수지상세포, 단핵세포 등에서 발현되며, 다양한 암세포에서 과다발현 된다고 보고되어 있다[26,27]. 많은 연구에서 CXCR6- CXCL16축은 암화과정, 동맥경화 및 염증반응에 주요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다[28,29]. 또한 혈관내 피세포의 증식, 관형성, 화학주성을 유발시켜 혈관신생 을 유도하는 혈관신생 촉진인자로 보고되었다[30]. 따라 서 치수의 생리적, 병리적 현상 및 치수 혈관신생에서 CXCR6-CXCL16의 생물학적 역할 및 그 작용기전에 관한 연구는 앞으로 더 진행해야 할 과제로 생각된다.