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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)
International Journal of Oral Biology Vol.41 No.4 pp.199-208
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2016.41.4.199

Identification of Non-Aggregatibacter actinomycetemcomitans Bacteria Grown on the Tryptic soy-Serum-Bacitracin-Vancomycin Medium

Eojin Jo, Soon-Nang Park, Joong-Ki Kook*
Korean Collection for Oral Microbiology and Department of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Chosun University, 375 Seosuk-Dong, Dong-Gu, Gwangju 501-759, Republic of Korea
Correspondence to: Joong-Ki Kook, Korean Collection for Oral Microbiology and Department of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Chosun University, 375 Seosuk-Dong, Dong-Gu, Gwangju 501-759, Republic of Korea. +82-62-230-6877, +82-62-224-3706jkkook@chosun.ac.kr
November 22, 2016 December 6, 2016 December 7, 2016

Abstract

The aim of this study was to identify the non-Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteria grown on the tryptic soy-serum-bacitracin-vancomycin (TSBV) medium, an A. actinomycetemcomitans selective medium. A total of 82 unidentified bacterial isolates from the oral cavities of a Korean population were kindly provide by the Korean Collection for Oral Microbiology. All the clinical isolates were grown on TSBV medium and bacterial DNA purified from each isolate was subjected to PCR with universal primers specific for bacterial 16S rRNA genes (16S rDNAs) sequence. The each bacterial 16S rDNA was amplified by PCR and the nucleotide sequences of it was determined by the dideoxynucleotide chain termination method. They were identified by 16S rDNA sequence comparison method at the specie-level. The data showed that Neisseria spp. (42 strains), Fusobacterium spp. (10 strains), Capnocytophaga spp. (8 strains), Propionibacterium acnes (5 strains), Aggregatibacter aprophilus (4 strains), Campylobacter spp. (5 strains), Veillonella dispar (3 strains), Streptococcus sp. (1 strain), Haemophilus parainfluenzae (1 strain), Leptotrichia wadei (1 strain), Morococcus sp./Neisseria sp. (1 strain), and Staphylococcus sp. (1 strain) were identified. These results could be used to develop a new A. actinomycetemcomitans-selective medium which is more effective than the TSBV medium in future studies.


초록


    National Research Foundation
    Ministry of Science, ICT and Future Planning
    NRF-2013M3A9B8013860

    서 론

    Aggregatibacter actinomycetemcomitans (= Actinobacillus actinomycetemcomitans = Haemophilus actinomycetemcomitans) 는 그람음성 비운동성 간균으로 미세호기성(microaerophilic) 세균으로 알려져 있다[1,2]. A. actinomycetemcomitans는 국소 유년형 치주염(localized juvenile periodontitis, 현재 진단명은 국소 급진성 치주염, localized aggressive periodontitis)의 주요한 원인균으로 보고되어[3], 특정 치 주질환의 원인균으로 처음 보고된 균종이다. 또한 성 인의 재발성 치주염[4] 및 성인의 급성 치주질환[5,6] 과의 밀접한 관련성이 있다고 보고되고 있다. A. actinomycetemcomitans는 구강질환 외에도 뇌농양[7,8], 폐 감염[9], 심장내막염[10-12], 울혈성 심부전[13] 및 방광 염, 요도염과 같은 비구강 감염에서도 검출되었다[14].

    A. actinomycetemcomitans의 대표적인 외독소는 백혈구 와 단핵 세포의 세포자살을 유도해서 세포를 사멸시키 는 leukotoxin[15-17]이 있으며, leukotoxin의 농도는 국소 적 급진성 치주염의 정도와 연관이 있는 것으로 보고되 었다[18]. 내독소인 지질다당류[19]는 숙주 세포 주기 (host-cell cycle)의 진행을 방해하는 이열성 치사 팽창 독 소(Cytolethal distending toxin; CDT)를 생산하여 파골세 포를 형성함으로써 뼈 흡수를 야기하므로 병원성이 높 은 것으로 보고되었다[20,21].

    A. actinomycetemcomitans의 세균-숙주 상호작용 연구 등 의 병인론 연구를 위해서는 사람의 구강에서 분리 및 동정 하는 것이 필요하다. 이를 위해 A. actinomycetemcomitans를 선택적으로 분리하기 위한 배지로 malachite green-bacitracin (MGB) 배지[22], TSBV (tryptic soy-serum-bacitracin-vancomycin) 배지[23], Dentaid-1 배지(brain-heart infusion agar에 0.5% yeast extract, 0.15% sodium fumarate, 0.1% sodium formate 및 9 μg/ml vancomycin 첨가)[24] 및 A. actinomycetemcomitans selective medium (AASM) 배지[25] 등이 개발되어 알려져 있다. 그 중에서도 tryptic soy agar 배지에 horse serum, yeast, bacitracin 그리고 vancomycin이 추가된 TSBV 배지가 A. actinomycetemcomitans의 성장과 분리를 위한 선택배지로 두 번째로 보고되었지만[23], TSBV 배지가 새로운 A. actinomycetemcomitans 선택배지 개발에 있어서 대조군으로 가장 많이 사용되었다[24,25]. 또한, TSBV 배지에는 말 혈청 성분이 포함되어 있어서 이 배지에서 성장하는 A. actinomycetemcomitans 콜로니 중심부에는 특징적인 별모양 이 있어 쉽게 구별할 수 있는 장점이 있다[2,25]. 하지만, 본 연구자 팀의 경험에 의하면 TSBV 배지에서 A. actinomycetemcomitans 이외의 여러 균종들이 자라나고, A. actinomycetemcomitans의 분리율은 매우 적었다. 또한, TSBV 배지에서 A. actinomycetemcomitans이외의 어떤 세균 종들이 자라는 지에 대한 연구는 미미하다. 그러므로 본 연 구는 TSBV 배지에서 자라나는 A. actinomycetemcomitans 이 외의 균주들을 16S rRNA 유전자(16S rDNA) 핵산염기서열 비교분석법을 이용하여 종 수준에서 동정하기 위해 시행하 였으며, 그 결과를 토대로 향후 연구에서 최대한 A. actinomycetemcomitans만을 분리할 수 있는 새로운 A. actinomycetemcomitans 선택 배지 개발의 기초 자료로 이용 하고자 한다.

    실험 재료 및 방법

    세균 및 세균배양

    본 연구에 이용된 균주들은 TSBV 배지에서 분리되었지 만, 종 수준으로 동정이 되지 않은 것으로 한국구강미생물 자원은행(KCOM, Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea)에서 분양받아 사용하였다(Table 1). 이들 균주들은 한국인의 치은염 부위, 치주염 부위 그리고 임플 란트 주위염의 치은연하 치면세균막을 비롯해 치주질환이 발생하지 않은 사람의 치은연하 치면세균막과 혀 부위에서 분리된 것들 이었다.

    모든 균주들은 TSBV (tryptic soy-serum-bacitracin-vancomycin) 한천배지(tryptic soy agar, 1% yeast extract, 10% horse serum, 75 μg/ml bacitracin 및 5 μg/ml vancomycin)에 도말하여 혐기 성(N2, 5% CO2, 5% H2) 조건이 제공된 37℃ 혐기성 세균배양 기(Bactron I, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 24-48시간 동안 배양하여 사용하였다.

    16S rDNA 클로닝

    본 연구에 사용된 균주들의 종 수준에서 동정은 16S rRNA 유전자(16S rDNA) 핵산염기서열 비교분석법을 이용 하여 시행하였다. 균주들의 16S rDNA을 중합효소연쇄반응 증폭을 위해서 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 프라이머들[26]을 사용하였다. 중합효소연쇄반응은 9 4℃에서 2분간 전변성(predenaturation)을 실시하고 94℃에 서 1분간 변성(denaturation), 55℃에서 30초간 결합 (annealing), 72℃에서 1분간 중합(extension) 과정을 30회 반 복하여 시행하고, 마지막 중합과정은 72℃에서 10분간 시행 하였다. 최종 중합효소연쇄반응 용액 중 2 μl씩을 채취하여 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동을 실시하여 중합효소연쇄 반응 산물의 증폭 여부를 확인하였다. 중합효소연쇄반응 증 폭물은 AccuPrep® PCR Purification Kit(Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 정제하였고, pGEM-T easy vector (Promega Co., Madison, WI, USA)에 제조회사의 지시에 따 라 결합(ligation)시키고, 이를 E. coli DH5α에 형질전환 하여 16S rDNA를 함유한 재조합 플라스미드로 형질전환된 균주 를 얻었다. 재조합 플라스미드는 AccuPrep® Plasmid Extraction Kit (Bioneer Co.)를 이용하여 제조회사의 지시대 로 추출하였다.

    16S rDNA 핵산염기서열 결정 및 상동성 검색

    재조합 플라스미드에 함유된 각 균주에서 클로닝한 16S rDNA의 핵산염기서열의 결정은 ChDC-GEM-F (5'-TTC CCA GTC ACG ACG TTG TAA AA-3')와 ChDC-GEM-R (5'-GTG TGG AAT TGT GAG CGG ATA AC-3') 프라이머들 을 이용하여 dideoxynucleotide chain termination 법을 이용하 여 바이오니아 사(Korea)에 의뢰하여 시행하였다.

    각 균주들의 16S rDNA 핵산염기서열들은 EzTaxon 프 로그램(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)을 이용하여 상동 성 검색을 하였고, 그 결과 98.7% 이상의 상동성을 보 이는 표준균주와 같은 종으로 판정하였다. 각 균주의 16S rDNA 핵산염기서열과 98.7% 이상의 상동성을 보이 는 세균종이 2개 이상인 경우 종-수준으로의 판정은 보 류하였다. 16S rDNA 핵산염기서열과 상동성이 기존의 세균 종들의 표준균주의 것과 98.0% 미만인 균주들은 새로운 균종이라 판정하였다.

    결 과

    본 연구에서 사용된 균주들의 16S rDNA 핵산염기서열 을 결정하여 EzTaxon 프로그램(http://www.ezbiocloud.net/ eztaxon)을 이용하여 상동성 검색한 결과 가장 높거나, 97% 이상의 상동성을 보이는 세균 종의 표준균주와의 상동성을 Table 2에 정리하였다. 본 연구에서 사용된 균주들의 16S rDNA 핵산염기서열과 98.7% 이상의 상동성을 보이는 표준 균주가 2개 이상일 경우 종-수준으로의 동정은 보류하고, 속(genus)-수준으로만 동정을 하였다(Table 3). 그 결과 13개 세균 종(Aggregatibacter aphrophilus, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Capnocytophaga ochracea, Haemophilus parainfluenzae, Leptotrichia wadei, Neisseria flava, Neisseria subflava, Propionibacterium acnes, Veillonella dispar)과 종-수준으로 동정이 안 된 4-5개 속 (Capnocytophaga sp., Neisseria sp., Neisseria sp./Morococcus sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp.)에 속하는 균주들이 TSBV 배지에서 자라는 것으로 확인하였다.

    기존의 표준균주들과 16S rDNA 핵산염기서열 상동성 이 98.0% 미만인 균주들 중에는 Capnocytophaga spp. 7 균주가 존재하였다(Table 3).

    같은 환자에서 분리된 세균 중 같은 종에 속하는 균주들 은 Table 4에 정리하였다. 그 결과 11명의 환자에서 분리된 균주들 중에는 같은 종에 속하는 균주들이 2개 이상 존재하 였다. 이들 균주들은 대부분 Neisseria spp.에 속하였다.

    고 찰

    본 연구에서 A. actinomycetemcomitans 선택배지인 TSBV 배지을 이용하여 한국인의 치면세균막 및 타액에서 분리된 82 균주를 16S rDNA 핵산염기서열 비교분석법에 의해 종 수준으로 동정한 결과 이들 균주들은 13개 종 및 종 수준에서 동정이 되지 않은 4-5개 속에 속하는 것임을 알 수 있었다. 본 연구에서 사용된 82 균주들 중 Capnocytophaga spp., Neisseria spp., Fusobacterium spp. 및 A. aphrophilus들이 각각 8, 42, 10 및 4 균주들이었는데, 이러한 결과는 기존의 TSBV 배지에서 자라는 A. actinomycetemcomitans 이외의 세균 종에 는 Capnocytophaga spp., Neisseria spp., 일부 Aggregatibacter spp. (A. aphrophilusA. segnis)가 있다는 보고[23,24]와 일치 한 것이었다. 선택배지에는 일반적으로 표적 세균 종이 잘 자랄 수 있도록 하기 위한 기본 배지 성분과 다른 세균 종의 성장을 억제하는 성분으로 구성되어 있다. 즉, TSBV 배지에 는 A. actinomycetemcomitans 성장을 위한 기본 배지인 tryptic soy agar와 그람 연쇄구균, 포도구균 및 actinomyces 등의 양성 세균의 성장을 억제시키기 위해 bacitracin과 vancomycin 이 첨가되어 있고, hemin을 성장에 필요로 하는 Hemophilus spp.의 성장을 억제하기 위해 양 피(sheep blood)를 사용하는 대신 말 혈청(horse serum)을 사용하였다[23]. 하지만, 본 연구 결과 연쇄구균 및 포도구균들이 각각 1 균주씩 동정되었다. 이러한 결과는 연쇄구균 및 포도구균 균주들은 bacitracin과 vancomycin에 대한 내성을 갖는 균주들이기 때문인 것으로 생각된다. 또한, 본 연구에서 동정된 Haemophilus parainfluenzae 종은 일반적으로 hemin이 성장에 필수적이지 않기 때문에 본 연구에서 1 균주가 동정된 것이라 생각된다. 본 연구에서 동정된 균주들은 향후 연구에서 효율적인 A. actinomycetemcomitans 선택배지 개발에 사용 가능할 것이라 생각된다.

    본 연구 결과 16S rDNA 핵산염기서열 비교분석법에 의해서 종-수준으로 동정이 되지 않은 19개의 Neisseria spp.에 속하는 균주들과 7개의 Capnocytophaga spp. 균주 들이 분리되었다. 이들 중 7개의 Capnocytophaga spp. 균 주들은 기존의 표준균주들의 16S rDNA 핵산염기서열과 98.0% 미만의 상동성을 보여 새로운 균종이라 생각된다. 세균을 종-수준으로 동정하는 황금 기준(golden standard)은 16S rDNA 핵산염기서열 결정법과 DNA-DNA hybridization 법으로 알려져 있다[27]. 16S rDNA 핵산염기서열의 상동 성을 기준으로 종-수준으로 구별할 때, 사용하는 가장 높 은 상동성은 연구 결과에 따라 97% 또는 98.7-99%까지 다양하게 제시되었다[27,28]. 그러므로 본 연구에는 이들 기준 중 98.7%을 선택하였다. 하지만, 세균 종에 따라서 는 16S rDNA 핵산염기서열이 서로 99% 이상이 경우가 많기 때문에 16S rDNA 핵산염기서열 비교 결정법으로는 완벽한 세균 종-수준에서의 동정이라고 할 수는 없으므로 DNA-DNA hybridization 법을 시행해야 하는 경우가 있다 [29]. 하지만, DNA-DNA hybridization 법은 연구자에 따라 매우 다양한 값을 얻을 수 있고, 편차가 크다는 단점이 있다. 최근 차세대 핵산염기서열 결정법의 눈부신 발전에 의해, 까다로운 DNA-DNA hybridization 법을 대체할 수 있는 세균 지놈 ANI (average nucleotide identity) 법이 소 개되었다[30,31]. 이들의 연구에 의하면, 두 세균을 다른 세균 종으로 분류할 수 있는 DNA-DNA hybridization 법의 기준이 70%에 해당하는 것이, ANI 분석에 의한 두 균주 간의 상동성이 94% 또는 95-96%라고 보고하였다[30,31]. 아직까지는 모든 세균 종들에 대한 ANI 분석에 의한 데 이터가 없고, DNA-DNA hybridization 법에 비해 경제적인 측면에서 단점은 있지만, 가까운 장래에는 DNA-DNA hybridization법을 대신하여 세균 종-수준에서의 분류에 황 금기준이 될 것이라 생각된다. 향후 연구에서 본 연구에 서 신종이라 생각되는 균주들의 지놈 핵산염기서열 결정 및 여러 분류학적 방법을 실시하여 신종 유무를 확인하는 실험을 진행하여야 할 것이다.

    본 연구에서 사용된 균주들은 혐기성 조건에서 분리된 균주들이었다. 이러한 이유로 본 연구에서도 혐기성 조건 에서 배양을 하여 본 실험에 사용하였다. 하지만, TSBV 배지를 이용하여 A. actinomycetemcomitans 균주를 배양할 경우 혐기성 조건보다는 5% CO2가 공급되는 공기 상태 에서 더 잘 자란다는 보고가 있다[32]. 그러므로 향후 연 구에서 A. actinomycetemcomitans 균주를 선택적으로 배양 하기 위해 TSBV 배지를 사용할 경우에는 5% CO2가 공급 되는 공기 상태에서 배양을 하고자 한다.

    최근의 연구에 의하면, TSBV 배지를 이용하는 것보다 Dentaid-1 배지를 이용할 경우 더 많은 수의 A. actinomycetemcomitans를 분리할 수 있으며, 배지를 만드 는 가격도 더 저렴하다는 것이 보고되었다[33]. 그러므로 현재까지 개발된 A. actinomycetemcomitans 선택배지 중에 서는 Dentaid-1 배지를 사용하는 것을 권장할 수 있다.

    이상의 연구 결과를 종합하면, TSBV 배지에는 A. actinomycetemcomitans 이외에도 A. aphrophilus, Campylobacter sp., Capnocytophaga sp., Fusobacterium sp., Neisseria sp., P. acnes, H. parainfluenzae, L. wadei, V. dispar 및 bacitracin 과 vancomycin에 내성을 갖는 연쇄구균과 포도구균이 자 랄 수 있음을 알 수 있었다. 향후 연구에서 본 연구 결과 에서 얻은 균주들을 이용하면, 효율성이 높은 A. actinomycetemcomitans 선택배지 개발이 용이할 것으로 생 각된다.

    감사의 글

    이 논문은 2013년도 정부(미래창조과학부)의 재원으로 한국연구재단 바이오·의료기술개발사업의 지원을 받아 수행된 연구임(NRF-2013M3A9B8013860).

    Figure

    Table

    Bacterial strains used in this study

    KCOM, Korean Collection for Oral Microbiology
    ChDC, Department of Oral Biochemistry, College of Dentistry, Chosun University

    Identification of clinical isolates by nucleotide sequence of 16S rDNA

    KCOM, Korean Collection for Oral Microbiology.

    The summary of the identification of the bacteria which were isolated from TSBV medium in this study

    KCOM, Korean Collection for Oral Microbiology.
    *Candidate of new species.

    Summary of the bacterial strains of same species isolated from same patients

    KCOM, Korean Collection for Oral Microbiology.
    *Candidate of new species.

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