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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)
International Journal of Oral Biology Vol.41 No.4 pp.231-236
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2016.41.4.231

Reactive Oxygen Species are Involved in Y-27632-induced Neurite Outgrowth in PC12 Cells

So Yeong Park, Seong Ah Moon, Jeong Mi An, Du sik Kim, Jeong Taeg Seo*
Department of Oral Biology, Yonsei University College of Dentistry, Seoul 120-752, Korea

† These authors contributed equally to this work.

Correspondence to: Jeong Taeg Seo, Department of Oral Biology, Yonsei University College of Dentistry, 50 Yonsei-ro, Seodaemungu, Seoul 120-752, Korea +82-2-2228-3054,jeong@yuhs.ac
November 21, 2016 December 12, 2016 December 13, 2016

Abstract

Inhibition of Rho-associated coiled coil-containing kinase (ROCK) has been reported to promote differentiation of neuronal cells. Here, we examined the effect of Y-27632, a ROCK inhibitor, on the outgrowth of neurites in PC12 cells. Y-27632 caused a rapid induction of neurite outgrowth in PC12 cells in a time-dependent manner. The neurite outgrowth, triggered by Y-27632, was accompanied by Rac1 activation, and was attenuated by Rac1 inhibitor NSC23766, in a concentration-dependent manner. Y-27632 also induced an increase in the production of reactive oxygen species (ROS). Pretreatment with N-acetylcysteine, an ROS scavenger, inhibited the ROS generation and neurite outgrowth in response to Y-27632. These results indicate that the activation of Rac1 and the generation of ROS contribute to the neurite outgrowth triggered by Y-27632 in PC12 cells.


초록


    Ministry of Science, ICT and Future Planning
    National Research Foundation
    2014R1A2A2A0 1007717

    서 론

    1998년 serine/threonine kinases인 Rho-associated coiled coil-containing kinase(ROCK)가 신경돌기 퇴축을 매개하 며, ROCK 억제제인 Y-27632가 미세소관(microtubule)의 중합을 촉진하여 신경돌기의 빠른 성장을 유도함이 밝 혀졌다[1]. 그후 신경손상과 관련된 다양한 질환 모델에 서 수행된 많은 연구를 통해, ROCK을 억제하는 경우 신경세포의 세포사가 억제되고 신경 분화가 촉진되는 효과가 관찰되었으며, 이를 근거로 ROCK 억제제가 신 경병성 통증, 척수손상, stroke, 알츠하이머병 등 신경세 포 손상과 관련된 질환의 치료제로서 연구되고 있다 [2-4]. 그러나 이와 같은 노력에도 불구하고 아직까지 ROCK 억제가 신경돌기를 성장시키는 기전은 정확하게 밝혀져 있지 않다. 다만 현재까지 수행된 많은 연구를 통해 신경돌기의 퇴축을 유도하는 RhoA-ROCK 신호가 억제되면 신경돌기의 성장을 유도하는 Rac1이 활성화되 어 미세소관의 중합반응이 촉진되는 것이 신경돌기 성 장의 주요 기전으로 생각하고 있으나[1], 신경세포의 분 화 과정에는 다양한 신호계가 관여하는 것으로 알려져 있기 때문에 ROCK 억제에 의한 신경돌기 성장 촉진 과정에도 Rac1 활성화에 의한 미세소관의 중합반응 촉 진 이외에 다른 기전이 관여할 것으로 보고 이를 밝히 기 위한 많은 연구가 수행되고 있다[5-7].

    한편, Rac1의 활성화는 미세소관의 중합반응을 촉진 함으로써 신경돌기의 성장을 촉진시키지만 그 외에도 다양한 신호계에 영향을 미친다. Rac1은 GTP가 결합함 으로써 활성화되는데, GTP-결합 Rac1은 NADPH oxidase 복합체의 구성요소로서 NADPH oxidase를 활성화시키고 활성산소종을 생성한다[8]. 활성산소종은 세포내 수많은 효소 및 단백을 산화시킴으로써 다양한 작용을 조절하 는데, 신경세포의 분화 및 성장에도 영향을 미치는 것으 로 알려져 있으므로[9] Rac1 활성화에 이은 NADPH oxidase의 활성화, 활성산소종의 생성이 ROCK 억제에 따른 신경돌기 성장에 관여할 가능성이 있다.

    따라서 본 연구에서는 흰쥐의 부신 수질 세포로부터 유래한 세포주로서 신경성장인자 자극에 의해 신경세포 로 분화하기 때문에 신경세포의 분화 과정을 연구하는 데 적절한 실험 모델로 이용되고 있는 PC12 세포를 이 용하여 ROCK 억제제인 Y-27632가 신경돌기를 형성할 때 Rac1과 활성산소종(reactive oxygen species)이 관여하 는지 확인하고자 한다.

    재료 및 방법

    시약 및 재료

    PC12 세포는 American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum, penicillin, streptomycin은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였으며 Y-27632와 Rac1 억제제인 NSC23766는 Tocris Bioscience(Ellisville, MO, USA)에서 구 입하였다. 항 Rac1 항체는 BD Transduction Laboratories(San Jose, CA, USA)에서, 2`,7`-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) 는 Molecular Probes(Eugene, OR, USA)에서 구입하였다. 그 외 활성산소종의 제거제인 N-acetylcysteine (NAC) 및 trolox 등은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사에서 구입 하였다.

    PC12 세포 배양

    PC12 세포는 10% horse serum, 5% FBS, 50 units/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin을 포함한 DMEM을 이용 하여 37°C에서 배양하였다. 신경돌기를 성장시키기 위해 Y-27632 등을 투여하기 전 배양액을 2% horse serum, 1% FBS, 50 units/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin을 포함한 DMEM으로 교체하고 약물을 투여하였다.

    신경돌기 생성 확인

    Y-27632에 의해 신경돌기가 자라나온 경우 그 길이가 PC12 세포의 세포체 크기보다 긴 경우를 유효한 신경돌 기로 간주하였다. 유효한 신경돌기를 생성한 세포의 숫 자를 전체 세포 숫자에 대한 비율로 표시하였다. 신경돌 기의 길이는 Imagepro 프로그램을 사용하여 측정하였다.

    Rac1 활성화 확인(GST-pull down assay)

    세포를 완충용액 (Tris (pH 7.4) 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 2mM, Glycerol 10%, NP-40 1%, DTT 1 mM, BM cocktail 20x)에서 반응시킨 다음 4°C에서 5분간 13,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 분리한다. 분리 한 세포추출액을 10 μg GST-CRIB과 overnight 동안 4°C 에 반응시킨 후, Glutathione-Sepharose bead와 함께 2시 간 동안 4°C에 둔다. Bead를 Tris (pH 7.4) 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 2mM, Glycerol 10%, NP-40 1%, DTT 1 mM을 함유한 용액으로 씻고 bead와 결합된 단백을 Laemmli 용액으로 추출한 후 12.5% SDS-PAGE로 전기 영동한다. 전기영동 후 nitrocellulose membranes으로 이동 시킨 전체 단백질을 5% 탈지분유(nonfat dried milk)에서 1시 간 동안 유지시킨 다음 항 Rac1 항체를 이용하여 반응시키 고 ECL detection system으로 GTP-Rac1과 Rac1반응 정도를 확인한다.

    활성산소종 생성 확인

    배양한 PC12 세포에 활성산소종과 반응하여 형광을 내는 물질인 DCF-DA 5 μg/ml를 30분 동안 처리하여 세포 내 축적 시킨 후 FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 excitation wavelength 488 nm와 emission wavelength 525 nm에서 세포 내 형광 강 도를 측정하였다.

    결 과

    Y-27632에 의한 PC12 세포 분화

    ROCK 억제제인 Y-27632가 PC12 세포의 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 그림 1A와 B에서 보는 바와 같이 Y-27632를 투여하기 전 PC12 세포는 둥근 형태이며 신경돌 기를 형성한 세포는 전체 세포 수의 3.4 ± 1.9 %(n=4)였다. 그러나 PC12 세포에 50 μM Y-27632를 처리하면 빠르게 신 경세포로 분화하여 1 시간 후에는 신경돌기를 형성한 세포 가 전체 세포 수의 42.1 ± 8.5 %(n=4)였다. Y-27632에 의해 신경세포로 분화한 PC12 세포 수는 시간이 지남에 따라 증 가하여 2 시간 후에는 76.3 ± 5.5 %(n=4), 3 시간 후에는 89.7 ± 4.1 %(n=4)였다.

    Y-27632에 의한 Rac1 활성화

    세포골격을 이루는 미세소관 및 액틴의 합성에 관여 하는 Rac1이 Y-27632에 의해 활성화되는지 확인하기 위 해 GST-pull down assay 방법을 이용하여 총 Rac1 양에 대한 GTP 결합 Rac1 양의 비율을 측정하였다(n=4). 그 림 2A와 B에서 보는 바와 같이 배양한 PC12 세포에 50 μM Y-27632를 처리한 결과 총 Rac1 양에 대한 GTP 결 합 Rac1 양의 비율이 증가하였으며, 특히 Y-27632 처리 30분 후에 최대치를 보였다.

    Rac1의 활성화가 Y-27632에 의한 PC12 세포의 분화 에 직접적으로 관련이 있는지 확인하기 위해 Rac1 억제 제인 NSC23766을 다양한 농도로 전처리한 후 Y-27632 를 투여하였다. 그림 2C와 같이 PC12 세포에서 50 μM Y-27632에 의한 신경 돌기 형성이 NSC23766 전처리에 의해 농도의존적으로 억제되었다(n=4).

    이와 같은 결과는 PC12 세포에서 Y-27632에 의한 신 경세포 분화에 Rac1의 활성화가 직접적으로 관여함을 보여 준다.

    Y-27632에 의한 활성산소종 생성

    PC12 세포에서 Y-27632에 의해 신경돌기가 생성될 때 활성산소종의 생성이 관여하는지 확인하기 위하여, 우선 활성산소종에 의해 형광을 내는 물질인 DCF를 축 적시킨 PC12 세포를 Y-27632로 처치하거나 활성산소종 의 제거제인 NAC을 전처치하고 Y-27632을 투여한 후 FACS를 이용하여 활성산소종 생성량을 측정하였다. 그 림 3A와 B에서 보는 바와 같이 50 μM Y-27632를 30분 동안 처치한 세포에서 세포 내 활성산소종이 증가하였 으며, 10 mM NAC을 전처리하고 Y-27632을 투여한 세 포에서는 Y-27632만 처리한 세포에 비해 세포내 활성산 소종의 양이 크게 감소하였음을 확인하였다(n=3).Fig. 3

    활성산소종 제거에 의한 PC12 세포 분화 억제

    Y-27632에 의한 PC12 세포의 분화에 활성산소종의 생성 이 관여하는지 확인하기 위해 활성산소종의 제거제인 NAC 을 전처치하고 Y-27632을 투여하여 신경돌기의 생성 정도 를 Y-27632 만을 투여한 세포의 신경돌기 생성과 비교하였 다. 그림 4A와 B에서 보는 바와 같이 50 μM Y-27632 만을 3 시간 투여한 경우 신경돌기를 형성한 세포가 총 세포 수에 비해 85.4 ± 4.1 %(n=7)이었으나 10 mM NAC 및 1 mM trolox 를 전처치한 후 50 μM Y-27632을 투여한 경우 신경돌기를 형성한 세포가 각각 39.1 ± 8.5 %(n=5) 및 43.7 ± 10.3 %(n=3) 로서 NAC과 trolox 전처리가 Y-27632에 의한 신경돌기 형성 을 통계적으로 유의하게 억제하였음을 확인하였다. 이와 같 은 결과는 Y-27632에 의한 PC12 세포의 분화에 활성산소종 의 생성 증가가 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

    고 찰

    신경세포가 손상을 받게 되면 신경돌기 성장 및 세포 생존을 억제하는 신호들이 활성화되어 신경세포의 재생 이 일어나지 못하고 세포사가 유발된다[10]. 이와 같이 신 경세포가 손상을 받았을 때 신경돌기 성장이 억제되고 세 포사가 유발되는 일련의 과정에 관여하는 세포내 신호전 달인자로서 ROCK이 중요한 역할을 한다[11]. 신경손상과 관련된 다양한 질환 모델에서 수행된 많은 연구를 통해, ROCK을 억제하는 경우 신경세포의 세포사를 억제하고 신경 분화를 촉진하는 효과를 관찰하였으며 이를 근거로 ROCK 억제제가 신경병성 통증(neuropathic pain). 척수손 상, 뇌졸중(stroke), 알츠하이머병 등 신경세포 손상과 관 련된 질환의 치료제로서 연구되고 있다[2-4].

    실험적으로 ROCK을 억제하면 신경세포의 퇴축 및 세 포사를 억제할 뿐 아니라 신경돌기의 빠른 성장을 유도하 여 신경세포의 분화 및 재생을 유도한다[12]. ROCK의 활 성화에 의해 신경돌기가 퇴축되는 과정에는 myosin light chain(MLC)의 인산화에 의한 actomyosin의 수축 과정이 관여하는 것으로 알려져 있지만[13], ROCK 억제가 신경 돌기를 성장시키는 기전은 아직 정확하게 밝혀져 있지 않 다. 다만, 단량체 G-단백(small G-protein)인 Rho와 Rac이 신경돌기의 성장에 서로 반대되는 역할을 함으로써 신경 세포 성장을 조절하므로, 신경돌기의 퇴축을 유도하는 Rho-ROCK 신호가 억제되면 상대적으로 Rac이 활성화되 고, 이에 의해 미세소관의 중합 반응이 촉진되어 신경돌 기의 성장을 유도하는 것이 가장 중요한 기전으로 생각되 고 있다[1].

    본 연구를 통해 ROCK의 선택적 억제제로 알려진 Y-27632가 PC12 세포의 신경분화를 빠르게 유도하며 Rac1을 활성화시키고, Y-27632에 의한 신경분화가 Rac 억제제에 의해 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다. 이 러한 결과는 Y-27632에 의한 PC12 세포의 분화 과정에 Rac1의 활성화가 핵심적인 역할을 한다는 것을 의미한다. 그러나 본 연구에서 PC12 세포에 Y-27632을 처리하면 시 간이 지남에 따라 30분 후까지는 Rac1의 활성화가 증가 하였으나 120분 후에는 오히려 활성화 정도가 감소하여 Y-27632에 의한 신경돌기 생성 경향과는 일치하지 않음 을 확인하였다. 이러한 차이는 이미 이전 연구에서도 확 인되었는데, PC12 세포에서 신경성장인자(nerve growth factor, NGF)에 의해 신경돌기가 생성되는 데에는 일반적 으로 3일 이상이 걸리지만 Rac1의 활성화는 신경성장인 자 투여 후 수 분 내에 일어나며 활성화 정도가 시간에 지남에 따라 감소함을 보였다[14, 15]. 이와 같이 세포 자 극 초기에 활성화되었다가 감소하는 Rac1 활성화 경향과 지속적으로 일어나는 신경돌기 생성 양상이 일치하지 않 는 이유는 아직까지 정확히 알려지지 않았으며 향후 연구 가 필요할 것으로 생각된다.

    Rac1의 활성화로 인해 신경돌기가 생성, 성장되는 과 정에는 p21-activated kinases(PAKs)의 활성화가 관여하는 것으로 알려져 있다[16]. GTP-Rac이 PAK과 결합하면 PAK은 자가인산화에 의해 활성화되고 세포골격의 재편 성을 유도한다[17]. 이와 같이 Rac1은 PAK과 결합하여 신경세포의 분화과정에 관여하지만, 한편으로는 NADPH oxidase의 구성요소로서 활성산소종의 생성에도 관여한 다. 따라서 Y-27632에 의해 Rac1이 활성화되면 PAK을 통해 신경돌기 생성을 유도하는 동시에 NADPH oxidase 를 활성화하여 활성산소종을 생성한다.

    활성산소종은 생체내 대사과정에서 생산되어 주로 세 포 독성을 야기하고 죽상경화증(atherosclerosis), 당뇨병, 퇴행성 뇌질환, 류마티스성 관절염 등 여러 가지 질환의 발병과 관련이 있으나[18-20] NADPH oxidase와 같은 효 소작용에 의해 일시적으로 증가하는 활성산소종은 세포 작용을 조절하는 중요한 이차전령체의 역할을 수행한다 는 것이 잘 알려져 있다[21]. 특히 NADPH oxidase 활성 화에 의해 생성되는 활성산소종이 신경세포의 신경돌기 성장점(growth cone) 형성에 관여한다는 보고가 있으므 로[22], Y-27632에 의한 신경세포 분화과정에도 Rac1 및 NADPH oxidase 활성화에 의해 생성되는 활성산소종이 관여할 가능성이 있다.

    본 실험을 통해 먼저 Y-27632가 PC12 세포에서 활성 산소종 생성을 증가시키는 것을 확인하였으며, 활성산소 종의 제거제가 Y-27632에 의해 증가된 활성산소종을 제 거하며 Y-27632에 의한 신경돌기의 성장을 부분적으로 억제하는 것을 보였다. 따라서 Y-27632에 의해 Rac1이 활성화되어 신경돌기가 성장할 때 이미 잘 알려져 있는 PAK의 활성화가 핵심적인 역할을 하겠지만 NADPH oxidase 활성화로 인해 생성되는 활성산소종도 신경돌기 성장을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 예상할 수 있다.

    활성산소종이 어떻게 신경돌기 성장을 촉진하는지 아 직까지 정확하게 알려져 있지는 않다. 활성산소종이 직 접적으로 액틴의 중합을 촉진하거나[22] extracellular signal-regulated kinase(ERK)를 인산화하여[23] 신경세포 의 분화를 촉진한다는 보고가 있으나 Y-27632에 의한 신경세포 분화에 활성산소종이 어떻게 작용하는지는 향 후 연구를 통해 밝혀야 할 과제이다.

    감사의 글

    이 논문은 2014년도 미래창조과학부의 재원으로 한국 연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(2014R1A2A2A0 1007717).

    Figure

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    Y-27632 caused neuronal differentiation of PC12 cells in a time-dependent manner.

    (A) Photomicrographs of PC12 cells incubated with 50 μM Y-27632 for the indicated times. The image in each panel is representative of 4 independent experiments. (B) Cells with neurites longer than the cell body diameter were counted and the percentage of neurite-bearing cells was determined. Results are presented as mean ± S.E.M. of 4 independent experiments; at least 50 cells/condition were analyzed in each experiment.

    IJOB-41-231_F2.gif
    Y-27632 induced Rac1 activation in PC12 cells.

    (A) PC12 cells were stimulated with 50 μM Y-27632 and Rac1 activation was determined by measuring the amount of GTP-bound Rac1. (B) Data from 4 experiments were quantified. Results are presented as mean ± S.E.M. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA and Bonferroni's test. *(Asterisk) indicates difference from the value at time 0 (p < 0.05). (C) The percentage of neurite-bearing cells was determined in Y-27632-stimulated PC12 cells in the presence of various concentrations of NSC23766. Results are presented as mean ± S.E.M. of 4 independent experiments; at least 50 cells/condition were analyzed in each experiment.

    IJOB-41-231_F3.gif
    Y-27632 induced ROS generation in PC12 cells.

    (A) PC12 cells were treated with 50 μM Y-27632 and 5 μM DCF-DA in the presence or absence of 10 mM NAC for 30 min and flow cytometric analysis was performed (n=3). The x-axis shows log fluorescence intensity and the y-axis indicates the cell number. (B) Quantification of P4 area is expressed as a percentage relative to the total number of cells. Results are presented as mean ± S.E.M. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA and Bonferroni's test. *(Asterisk) indicates difference from the control value (P < 0.05).

    IJOB-41-231_F4.gif
    ROS were involved in Y27632-caused neuronal differentiation in PC12 cells.

    (A) Photomicrographs of PC12 cells incubated with 50 μM Y-27632 for 3 h in the presence or absence of 10 mM NAC or 1 mM trolox. The image in each panel is representative of 3-7 independent experiments. (B) PC12 Cells with neurites longer than the cell body diameter were counted and the percentage of neurite-bearing cells was determined. Results are presented as mean ± S.E.M. of 3-7 independent experiments; at least 50 cells/condition were analyzed in each experiment. Statistical analysis was performed using an unpaired Student’s t-test. *(Asterisk) indicates difference from the control value (P < 0.05). NAC: N-acetylcysteine

    Table

    Reference

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