서 론
신경성장인자로 알려져 있는 glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF) 집합체는 GDNF, neurturin, persephin, 그리고 artemin으로 구성되어 있으며[1-4], 세포 의 성장, 분화, 이동 등을 포함하는 다양한 기능에 관여하 는 것으로 알려져 있다[5]. 그 중 artemin은 뉴런의 생성, 발달, 유지에 관여하며[5-7], 축삭생성[8]과 신경재생[9,10] 등에서 중요한 역할을 담당한다.
최근 연구는 artemin이 통증조절에 중요하게 작용한다 는 사실을 보고하였다. Artemin을 흰 쥐 발바닥의 피하 조직으로 투여하였을 때 열통증 반응이 유발되어 4시간 동안 유지되었고[11], 냉자극에 대한 반응을 유의하게 증가시켰다[12]. 그리고 유전자를 조작하여 피부에서 특 이적으로 artemin의 발현을 증가시킨 흰 쥐에서 열자극 에 대한 역치가 대조군과 비교하였을 때 유의하게 감소 한 것을 확인하였다[13]. 이러한 연구 결과들은 artemin 이 말초조직에서 통증 신호전달에 중요한 역할을 한다 는 것을 보여주고 있다.
일차구심성 신경에서 transient receptor potential vanilloid 1(TRPV1)이나 glutamate 이온통로와 같이 다양한 종류의 이 온통로가 통증전도에 관여한다고 알려져 있다[14-18]. TRPV1 수용기는 주로 작은 직경의 일차구심성 신경섬유에 서 발현하는데[19] 염증과 신경 손상이 발생하였을 때 열통 증을 전도한다[20,21]고 알려져 있다. TRPV1 수용기뿐만 아 니라, glutamate 수용기 중 ionotropic glutamate 수용기도 일 차구심성 신경에서 통증전도나 통증과민현상을 야기하는 것으로 알려져 있다[22-24]. Ionotropic 수용기 중 NMethyl- D-aspartate(NMDA)와 α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic acid(AMPA) 수용기 대항제를 피하로 투여 하였을 때 IL-1β로 유발되는 기계적 이질통증을 차단시켰 다[25]는 연구 결과들은 말초신경말단에 존재하는 NMDA 나 AMPA 수용기가 말초조직에서 발생하는 통증에 중요한 역할을 담당한다는 것을 증명해 준다. 그러나 artemin에 의 해 유도되는 통증반응에 말초신경말단에 존재하는 이온 통 로 수용기들의 역할에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
본 연구는 artemin을 실험동물 흰 쥐의 안면영역의 피 하조직으로 투여하였을 때 나타나는 기계적 이질통증과 열통증을 평가하였고, TRPV1, NMDA, AMPA 수용기를 차단하였을 때 artemin에 의해 유도되는 통증반응에 미 치는 영향을 알아보았다. 또한, artemin 주입으로 발생하 는 통증에 단백질 인산화효소가 어떠한 역할을 하는지 알아보았다.
재료 및 방법
실험동물과 수술
실험동물은 수컷 Sprague-Dawley계 흰 쥐(230~280 g) 를 사용하였고, 경북대학교 치의학전문대학원 동물실에 서 일정한 온도와 12시간 주/야 빛의 순환주기를 갖는 환경에서 실험동물용 사료와 물을 자유롭게 공급하여 사육하였다. 본 연구는 경북대학교 실험동물위원회의 승 인(2015-0053)을 얻었으며, 의식이 있는 동물 실험에 관 한 세계통증연구학회의 윤리적 규정을 준수하였다. 실험 동물은 ketamine(40 mg/kg)과 xylazine(4 mg/kg) 혼합액으 로 마취한 뒤, 약물을 항상 일정한 위치에 동일하게 투 여하기 위해 마취된 쥐의 왼쪽 안면영역에서 3번째 줄 의 5번째에 위치하고 있는 수염부분에 폴리에틸렌관 (PE10, Clay Adams, Parsippany, NJ)을 삽관하였다. 수술 후 72시간 동안 실험동물을 회복시켰다.
안면통증의 평가
행위반응을 관찰하기 위해 실험동물이 목을 빼내어 자유롭게 움직일 수 있도록 설계된 투명한 플라스틱 관 찰용 통에 한 마리씩 넣어 실험을 수행하였다. 모든 행 동반응의 측정은 블라인드 테스트로 수행하였다.
열통증의 평가: 열자극은 레이저 자극기(Infrared Diode Laser, LVI-808-10, LVI Technology, Seoul, Korea)를 이용하 여 피부로부터 10 cm 떨어진 곳에서 90도 각도로 적용하 였다[30-32]. 안면영역에 열자극을 적용한 다음 얼굴을 피 하는 시간(head withdrawal latency)을 측정하여 평가하였 다. 실험동물에서 열통증의 평가는 5분의 시간 간격을 두 고 2번의 자극을 가한 다음 평균값을 산출하였으며, 조직 손상을 방지하기 위해 cut-off time을 20초로 설정하였다.
이질통증의 평가: 기계적 이질통증을 평가하기 위해 공 기자극 테스트(air-puff test)를 이용하였는데[25-27], 삼차 신경이 지배하는 안면영역에 가해지는 연속된 10번의 공 기자극을 4초 동안 10초의 간격으로 주었을 때 머리를 회 피하거나 깨무는 등의 공격적인 행동을 행위반응의 평가 기준으로 삼았다. 공기자극은 금속관(26 gauge, 10 cm)을 통해 피부로부터 1 cm 떨어진 곳에서 90도 각도로 적용하 였다. 공기자극 세기와 간격은 pneumatic pump module (BH2 system, Harvard Apparatus, USA)로 조절하였다. 자극 의 역치는 총 시도에서 50% 이상의 반응을 보인 경우로 평가하였으며[27-29], 40 psi 이상의 자극에서도 반응이 나 타나지 않으면 자극을 중지하였다. 정상적인 동물은 압력 세기가 40 psi 이하인 경우 어떠한 통증 반응도 나타내지 않았다.
실험 프로토콜
Artemin의 통증유발 작용: 피하에 삽입되어 고정된 폴 리에틸렌관을 이용하여 0.5 또는 1 μg의 artemin을 투여 한 후 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 24, 48, 72 그리고 96시간에 열 자극을 가하여 회피하는 시간을 측정하여 열통증이 발 생하는지 평가하였다. 그리고 안면피부에 공기자극을 가 하여 공기자극 역치를 평가하여 이질통증이 발생하는지 알아보았다.
TRPV1 ionotropic glutamate 수용기의 역할: Artemin을 투 여하기 10분 전에 TRPV1 수용기 대항제인 iodoresiniferatoxin (IRTX, 4 μg), NMDA 수용기 대항제인 D-AP5(40, 80 μg) 그리고 AMPA 수용기 대항제인 NBQX(20, 40 μg)를 폴리에 틸렌관을 이용하여 말초로 각각 투여하였다. 이어서 artemin (1 μg)을 주입한 다음 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 240 그리고 1440분에 열자극에 회피하는 시간을 측정하여 열통증에 미 치는 영향을 평가하였다.
단백질 인산화효소의 역할: Artemin을 투여하기 10분 전에 단백질 인산화효소 A의 억제제인 H-89(10, 20 μg) 와 단백질 인산화효소 C의 억제제인 chelerythrine(10, 20 μg)을 폴리에틸렌관을 이용하여 말초로 각각 투여하였다. 이어서 artemin(1 μg)을 주입한 다음 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 240 그리고 1440분에 열자극에 회피하는 시간 을 측정하여 열통증에 미치는 영향을 평가하였다.
실험에 사용한 약물
실험에 사용한 artemin와 TRPV1 수용기 대항제인 IRTX (6,7-deepoxy-6,7-didehydro-5-deoxy-21-dephenyl-21-(phenylmethl)- daphnetoxin,20-(4-hydroxy-5-iodo-3-methoxybenzene-acetate) 는 R&D system(Minneapolis, MN)에서 구입하였고, IRTX를 제외한 모든 대항제와 억제제는 Tocris Bioscience(Langford, Bristol, UK)에서 구입하였다. Artemin과 AMPA 수용기 대항 제인 NBQX(2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]quinoxaline- 7-sulfonamide dosidium salt)는 멸균된 phosphate buffered saline(PBS)에 용해시켰으며, IRTX는 생리식염수에 10% DMSO와 0.2% ethanol 그리고 0.6% Tween 80을 혼합한 용액 에 용해시켰다. NMDA 수용기 대항제인 D-AP5(D-(-)-2- amino-5-phosphonopentanoic acid)와 단백질 인산화효소 A 억제제인 H-89(N-[2-[[3-(4-bromophenyl)-2-propenyl]amino] ethyl]-5-isoquinoline-sulfonamide dihydrochloride), 단백질 인 산화효소 C의 억제제인 chelerythrine(1,2-dimethoxy-12-methyl [1,3]benzodioxolo[5,6-c]phenanthridinium-chloride)은 멸균된 생리식염수에 용해시켰다.
통계분석
실험결과의 유의성을 검증하기 위해 다중 그룹에서 반 복측정자료의 분산분석법과 Sidak 사후 분석법을 이용하 였다. 개별 시간에 따른 유의성을 확인하기 위해서 일원 배치분산분석 (ONE-WAY ANOVA)를 실시하였다. 통계 적인 비교를 위해 통계적 유의성의 표준값은 P<0.05로 설 정하였다. 모든 결과는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시하 였다.
결 과
정상상태의 실험동물에서 artemin(0.5, 1 μg)을 안면 피 하조직으로 주입한 다음 열자극을 가할 때 회피반응이 나 타나는 시간과 공기자극을 안면 피부에 가하여 회피반응 을 나타내는 공기자극 역치를 그림 1에 나타내었다. 열자 극에 대한 회피반응 시간을 측정한 결과 농도 의존적으로 유의하게 감소시켰다(Fig 1A, p<0.05). Artemin 투여 후 나 타나는 열통증은 24시간에 최고로 나타났고, 약물 주입 후 48시간까지 지속되다가 72시간이 지난 뒤에 정상으로 회복되었다. 대조군으로 약물의 용매(vehicle)만을 주입하 였을 때 열자극으로 부터 회피하는 반응시간에 아무런 영 향을 주지 못하였다. 그러나 안면 피하조직으로 주입된 artemin은 공기자극 역치에 아무런 영향을 주지 못하였다 (Fig. 1B).
그림 2는 TRPV1 수용기를 차단하였을 때 artemin을 투 여하여 유발되는 열통증에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타내었다. TRPV1 수용기 대항제인 IRTX(4 μg)를 전처 치하면 artemin을 안면의 피하조직으로 투여하였을 때 나 타나는 열통증이 유의하게 억제되었고(p<0.05), 통증억제 작용은 약물 주입 후 120분까지 지속되었다. 그러나 대조 군으로 vehicle을 투여하면 artemin에 의해 발생하는 열통 증에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 그리고 정상상태의 실험동물에 본 실험에 사용한 농도의 IRTX을 투여하면 열자극을 가했을 때 나타나는 회피반응 시간에 아무런 영 향을 주지 못하였다.
NMDA와 AMPA 수용기를 차단하였을 때 aretmin으로 유도되는 열통증에 미치는 영향을 평가하여 그림 3에 나 타내었다. NMDA 수용기 대항제인 D-AP5(40, 80 μg)를 전처치하면 artemin으로 인한 열통증 반응을 유의하게 억 제하였다(p<0.05). 그러나 AMPA 수용기 대항제인 NBQX (20, 40 μg)를 전처치하면 artemin으로 인한 열통증 반응에 아무런 영향을 주지 않았다. 그리고 정상상태의 실험동물 에 본 실험에 사용한 농도의 D-AP5와 NBQX을 투여하면 열자극을 가했을 때 나타나는 회피반응 시간에 아무런 영 향을 주지 못하였다.
그림 4는 단백질 인산화효소 A와 C를 차단하였을 때 artemin으로 인해 유발되는 열통증에 미치는 영향을 평가 한 결과이다. 단백질 인산화효소 A의 억제제인 H-89(20 μ g)를 전처치하면 artemin으로 인한 열통증 반응이 유의하 게 억제되었다(p<0.05). 또한 단백질 인산화효소 C의 억제 제인 chelerythrine(20 μg)도 열통증을 유의하게 감소시켰 다(p<0.05). 그러나 낮은 농도의 단백질 인산화효소 A와 C의 억제제는 artemin에 의해 유도되는 열통증에는 아무 런 영향을 주지 못하였다. 그리고 정상상태의 실험동물에 본 실험에 사용한 농도의 H-89와 chelerythrine을 투여하면 열자극을 가했을 때 나타나는 회피반응 시간에 아무런 영 향을 주지 못하였다.
고 찰
본 실험에서 artemin을 안면 피하조직으로 주입하면 기 계적 이질통증은 나타나지 않았으나 열통증이 농도 의존 적으로 나타났다. TRPV1 수용기 대항제인 IRTX와 NMDA 수용기 대항제인 D-AP5의 전처치는 artemin으로 인해 유발되는 열통증을 유의하게 감소시켰지만, AMPA 수용기 대항제인 NBQX는 아무런 영향을 미치지 못했다. 또한, 단백질 인산화효소 A와 C의 억제제인 H-89와 chelerythrine도 모두 artemin으로 인한 열통증을 유의하게 완화시켰다. 이러한 실험 결과는 artemin으로 인해 유발되 는 열통증이 단백질 인산화효소 A와 C를 통하여 TRPV1 수용기와 NMDA 수용기를 활성화시켜 전도된다는 것을 보여준다.
본 연구에서 artemin을 안면 피하조직으로 투여하면 열 통증이 발생했다. Artemin이 말초조직에서 열통증을 발생 시킬 수 있다는 사실은 선행 연구결과들을 통해 알 수 있 다. 흰 쥐의 발바닥에 artemin을 주입하였을 때 열자극에 대한 회피반응 시간이 유의하게 감소하였고[12], 이때 유 발되는 열통증이 4시간까지 나타났다[11]는 보고는 본 실 험결과와 일치한다. Artemin을 특이적으로 과다 발현시킨 쥐에서 피부의 C섬유 통각감수기 역치 값이 감소하여 통 증이 발생한다[13]는 실험결과는 artemin이 가는 신경섬유 인 C 신경섬유를 통하여 열통증을 유발시킨다는 것을 증 명해 주고 있다. 또한 본 실험에서 안면 피하조직으로 주 입한 artemin은 기계적 이질통증을 유발하지 못하였다. 이 러한 실험 결과는 선행연구에서 artemin을 투여한 실험동 물에서 굵은 신경섬유에 의해 전도되는 기계적 이질통증 을 유발시키지 못하였다[12,13]는 실험결과와 일치한다. 그러나 artemin을 5일 동안 연속으로 투여하였을 경우는 기계적 이질통증이 유발되었다는 보고[33]도 있어 굵은 신경섬유를 통한 통증 전도에 대한 연구는 향 후 더 이루 어져야 할 것으로 판단된다.
TRPV1 수용기는 후근신경절이나 삼차신경절에 존재하 는 작은 사이즈의 신경세포에 존재하여[34,35] 염증성 또 는 신경병증성 열통증에 전도에 중요한 역할을 담당한다 [36-38]고 알려져 있다. 유전자 조작으로 TRPV1 수용기를 제거한 실험동물에서 CFA를 주사하여 염증을 유발하였 을 때 정상상태의 실험동물과 비교하여 보면 기계적 자극 으로 발생하는 통증은 잘 나타났으나 열자극을 가할 때 나타나는 열통증은 발생하지 않았다[39]. 이러한 실험 결 과는 TRPV1 수용기가 열통증을 전도하는데 매우 중요한 역할을 한다는 것으로 말해주고 있으며 본 연구에서도 TRPV1 수용기 대항제를 전처치하면 artemin에 의해 유도 된 열통증을 유의하게 억제하였다. 나아가 artemin이 작용 하는 수용기인 GFRα3가 주로 말초 신경계에서 존재하며 [7,40,41], TRPV1 수용기와 같이 존재한다[11,13,42]는 실 험 결과는 artemin에 의해 발생하는 열통증에 가는 신경 섬유에서 열통증을 전도한다고 알려져 있는 TRPV1 수용 기가 중요한 역할을 담당한다는 것을 증명하고 있다.
일반적으로 NMDA 수용기는 말초와 중추 신경계에서 시냅스 전달과 가소성에 중요한 역할을 하고 있다고 알려 져 있다[43-46]. 본 연구는 TRPV1 수용기 뿐만 아니라 NMDA 수용기도 artemin에 의해 유도되는 열통증에 관여 한다는 것을 보여주고 있다. NMDA 수용기 대항제인 D-AP5를 전처치하면 artemin으로 인한 열통증 반응을 유 의하게 억제하였다. 말초조직에서 NMDA 수용기가 통증 을 조절한다는 사실은 많은 선행연구를 통해 밝혀져 있다. 실험동물 흰 쥐에 NMDA 수용기 대항제로 알려진 MK- 801을 피하로 주입하면 carrageenan으로 인한 염증에 의해 감소한 기계적인 역치 값이 증가하였고[22,47], 포르말린 주입으로 나타나는 통증 행위반응이 완화되었다[48,49]는 선행 연구 결과들을 통해서 말초조직에서 NMDA 수용기 가 통증의 전도와 유지에 관여하고 있다는 증명한다. 뿐만 아니라, 삼차신경절의 교근을 지배하는 구심성 신경에서 NMDA 수용기의 아단위인 NR1과 TRPV1 수용기가 면역 염색을 통해 같이 존재한다는 사실을 보고[50]하였고, 면 역침강법을 통해서 A-kinase anchoring protein 150이 NMDA 수용기와 TPRV1 수용기의 결합체를 형성하여 TRPV1의 세린 800 잔기에서 인산화를 시킨다고 보고하였 다[51]. 이러한 실험결과는 NMDA 수용기가 TRPV1 수용 기와 동일한 신경섬유에서 존재하며 두 종류의 수용기가 서로 상호작용을 나타낼 수 있다는 것으로 보여 주고 있 다. 따라서 이들 실험 결과로 미루어 볼 때 artemin으로 유 발되는 열통증에 말초조직에 존재하는 TRPV1 수용기와 NMDA 수용기가 가 중요한 역할을 담당하고 있으며 이들 두 수용기의 상호작용이 가능할 수 있다는 것으로 보여 주 고 있다.
본 연구에서 단백질 인산화효소 A 억제제인 H-89와 C 억제제인 chelerythrine을 전처치하면 artemin으로 인한 열통 증을 유의하게 억제하였다. 일반적으로 단백질 인산화효소 는 이온통로를 인산화하여 통로를 활성화시켜 말초조직에 서 통각 전도를 조절하는 중요한 역할을 한다고 알려져 있 다[52-54]. 단백질 인산화효소 C의 억제제인 chelerythrine을 전처치하였을 때 IL-1β로 인한 열통증 행위반응이 억제되 었고, 면역염색법으로 관찰한 결과 삼차신경절에서 TRPV1 수용기가 나타나는 작은 크기의 신경세포에서 단백질 인산 화효소 C를 함께 관찰할 수 있었다[25]. 또 다른 선행연구 에서는 삼차신경절에서 A-kinase anchoring protein 150으로 인해서 단백질 인산화효소 A가 TRPV1 수용기를 인산화시 켜서 감작시킨다고 보고[55]하였다. 이러한 실험결과들은 종합해 볼 때 단백질 인산화효소가 TRPV1이나 NMDA 수 용기를 인산화시켜서 artemin으로 인한 열통증 발생에 관 여한다는 것으로 추론해 볼 수 있으나 더 정확한 기전을 밝히기 위해서는 추가적인 실험이 요구된다.
이상의 실험결과를 종합하여 보면 단백질 인산화효소 A와 C를 통해서 TRPV1과 NMDA 수용기가 활성화하여 artemin이 열통증을 유발하는 것으로 판단된다. 이러한 실 험 결과는 열통증을 조절하는 진통제를 개발하는데 말초 신경에 존재하는 이온채널 수용기를 조절하는 것이 중요 하다는 실험적 근거를 제시해 주고 있다.
