서 론

Peptoniphilus mikwangii는 그람 양성의 혐기성 세균으 로 한국인의 상악 측절치와 견치 사이 부위의 수술 후 감 염 병소에서 처음 분리되었다[1]. Peptoniphilus 속은 Anaerococcus, Gallicola, Parvimonas 및 Finegoldia 속들과 더불어 사람의 구강 정상 세균 총을 이루는 그람 양성의 혐기성 구균들이다[2-5]. P. mikwangii의 구강 내 감염성질 환과의 관련성은 아직 밝혀져 있지 않고 있다.

치주질환, 치수염, 치근단질환 및 악골골수염과 같은 구강 내 감염성질환과 특정 세균 종(species) 간의 역학 관계를 밝히기 위해서는 해당 세균 종에 대한 검출법이 확립되어야 한다. 현재까지 개발된 여러 세균 검출법들 중에서 중합효소연쇄반응법은 신속하고 정확한 방법으 로 현재 많이 사용되고 있다[6]. 중합효소연쇄반응법을 수행하기 위해서는 종-특이 중합효소연쇄반응 프라이머 의 개발이 필요하고, 이를 위해서는 표적 유전자를 선정 하여야 한다. 중합효소연쇄반응 프라이머 개발을 위해 사용되는 표적 유전자는 모든 세균들에게 존재하며, 종 간의 상이하면서 같은 세균 종 내의 균주들 간의 상동 성이 잘 보존된 염기서열이 존재해야 한다. 이러한 조건 을 만족하는 유전자들 중에서 16S ribosomal RNA 유전 자(16S rDNA)가 많이 사용되고 있다[7-9].

본 연구는 최근 한국인에서 처음으로 분리 동정된 P. mikwangii에 대한 종-특이 중합효소연쇄반응 프라이머를 16S rDNA 핵산염기서열을 기반으로 개발하기 위해 시행하였다.

재료 및 방법

세균 및 세균 배양

본 연구에서 사용된 균주들은 KCOM (Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea), ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), KCTC (Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Daejeon, Korea) 및 CCUG (Culture Collection, University of Göteborg, Göteborg, Sweden)에서 분양받아 사용하였다 (Table 1).

Neisseria spp., Enterococcus spp. 및 Streptococcus spp. 균주 들은 brain heart infusion (BHI, BD diagnostics, Spark, MD, USA) 배지를 이용하여 37℃ 호기성 세균배양기(Thermo Forma, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다[10]. Aggregatibacter actinomycetemcomitans 균주들은 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratories)에 0.6% yeast extract, 5% horse serum, 75 μg/ml bacitracin 및 5 μg/ml vancomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 배지에서 배양하였다[10]. 그 외 균주들 은 TSB에 0.05% cysteine HCl-H₂O, 0.5% yeast extract, 0.5 mg/ml hemin 및 2 μg/ml vitamin K1이 첨가된 배지를 이용하 여 혐기성 조건(85% N₂, 10% CO₂, 5% H₂) 하에 37℃ 혐기성 세균배양기(Bactron I, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 배양하였다[10].

P. mikwangii 종-특이 중합효소연쇄반응 프라이머 쌍 설계

P. mikwangii의 16S rDNA 핵산염기서열(GenBank accession no. KJ728812)을 바탕으로 PrimerSelect 프로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 중합효소연쇄반응 프 라이머 두 쌍을 설계하였으며 다음과 같았다; B134-F11, 5′-CCA AGT CGC ATG ACA TGG AAA TC-3′; B134-R1, 5′-GGC GGA GTG CTT ATT GTG TTT-3′. B134-F5, 5′ -GCA AGT CGA GCG ATG AAA AGG-3′; B134-R5, 5′ -TGT TTA CTG CGG CAC CGA GAT TAC-3′. 이들 중합 효소연쇄반응 프라이머 쌍들의 예상되는 PCR 증폭물의 크기는 각각 668 bp 및 796 bp였다. 이때 설계된 primer 쌍은 Bioneer 사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.

P. mikwangii 종-특이 중합효소연쇄반응 프라이머 쌍 들의 최적결합온도 결정, 종-특이성 및 민감도 검증

중합효소연쇄반응의 주형으로 사용할 세균의 지놈 DNA들은 선행연구에서 제시한 방법으로 추출하여 사용 하였다[10].

P. mikwangii를 종-특이적으로 검출하기 위해 설계된 PCR 프라이머 쌍들(B134-F11/B134-R1 및 B134-F5/B134-R5)의 최적 결합온도(optimal annealing temperature)를 구하기 위하여 AccuPower^® PCR PreMix (Bioneer) 및 MyGenie^TM 96 Gradient Thermal Block (Bioneer)을 사용하여 gradient PCR을 실시하 였다. 이때 P. mikwangii KCOM 1628^T와 유전학적으로 가장 가까운 P. asaccharolyticus KCTC 3321^T 지놈 DNA를 주형으 로 사용하였다. PCR 반응 용액에는 세균 지놈 DNA 4 ng, 중합효소연쇄반응 프라이머 1 pmole/μl 씩 넣어 사용하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 전변성 처리하였고, 9 5℃에서 10초간 변성, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 또는 70℃에 서 20초간 결합, 72℃에서 30초 동안 중합 과정을 30회 시행 하고, 72℃에서 5분간 최종 중합과정을 시행하였다. 중합효 소연쇄반응이 끝난 후, 총 반응물 중 4 μl를 1.5% 아가로스 젤을 매질로 전기영동하여 중합효소연쇄반응 증폭 여부를 확인하였다. 이때, 전기영동은 Tris-acetate buffer (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA, [pH8.0])를 전해질로 사용하여 100V에서 15분간 실시하였으며, 증폭물은 GoodView^TM Nucleic Acid Stain (SBS Greetech, Beijing, China)으로 염색하 여 UV transilluminator로 확인하였다[10].

PCR 프라이머 쌍들(B134-F11/B134-R1 및 B134-F5/B134-R5) 의 P. mikwangii에 대한 종-특이성 검증을 위한 PCR 반응조 건은 gradinet PCR과 같았고, 다만 결합온도는 B134- F11/B134-R1 쌍의 경우 64℃, B134-F5/B134-R5 쌍의 경우 68℃로 사용한 것만 차이가 있었다.

PCR 프라이머 쌍들(B134-F11/B134-R1 및 B134-F5/B134-R5) 의 민감도는 P. mikwangii KCOM 1628^T의 지놈 DNA를 4 ng부터 4 fg까지 10배씩 희석하여 중합효소연쇄반응을 시행하여 측정하였으며, 이때 중합효소연쇄반응 조건은 위에 기술한 종-특이성 검증 시와 같았다.

결 과

P. mikwangii을 종-특이적으로 검출하기 위해 16S rDNA 핵산염기서열을 기반으로 설계된 중합효소연쇄반응 프라 이머 쌍들(B134- F11/B134-R1 및 B134-F5/B134-R5)의 적정 결합온도를 측정한 결과, P. mikwangii KCOM 1628^T 지놈 DNA를 주형으로 한 경우 B134- F11/B134-R1 쌍은 68℃까 지 PCR 증폭물이 생성되었지만, 64℃까지 가장 진한 PCR 증폭물이 보였다. B134-F5/B134-R5 쌍의 경우 70℃까지 비 교적 비슷한 진하기의 PCR 증폭물이 생성되었다(Fig. 1). 반면에 대조군으로 사용한 P. asaccharolyticus KCTC 3321^T 지놈 DNA에서는 B134- F11/B134-R1 및 B134-F5/B134-R5 쌍을 이용하여 PCR를 시행한 결과 본 실험에 사용한 모든 결합온도에서 PCR 산물이 증폭되지 않았다(Fig. 1). 이러한 결과를 바탕으로 B134- F11/B134-R1 및 B134-F5/B134-R5 쌍의 최종 결합온도를 각각 64℃ 및 68℃로 정하였다.

P. mikwangii을 검출하기 위해 16S rDNA 핵산염기서열을 기반으로 설계된 중합효소연쇄반응 프라이머 쌍들(B134- F11/B134-R1 및 B134-F5/B134-R5)의 종-특이성을 조사한 결과, 본 실험에 사용된 3균주의 P. mikwangii 지놈 DNA에 서만 668 bp과 796 bp의 PCR 증폭물이 확인되었다(Fig. 2). 또한 P. mikwangii를 제외한 6종 Peptoniphilus spp. 표준균주 들을 포함한 구강 내 세균 종들의 지놈 DNA에서는 중합효 소연쇄반응 증폭물이 확인되지 않았다(Fig. 2).

본 연구에서 P. mikwangii를 종-특이적으로 검출하기 위 해 설계된 PCR 프라이머 쌍들(B134-F11/B134-R1 & B134- F5/B134-R5)의 민감도(최소검출한도)를 측정하기 위해 P. mikwangii KCOM 1628^T의 지놈 DNA를 4 ng부터 4 fg까지 10배씩 희석하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 그 결과 B134-F11/B134-R1 프라이머 쌍은 400 fg까지, B134-F5/ B134-R5 프라이머 쌍은 40 fg까지 P. mikwangii KCOM 1628^T의 지놈 DNA를 검출할 수 있었다(Fig. 3).

고 찰

본 연구 결과 P. mikwangii를 종-특이적으로 검출하기 위 해 16S rDNA 핵산염기서열을 기반으로 설계된 B134-F11/ B134-R1 및 B134-F5/B134-R5 프라이머 쌍들은 중합효소 연쇄반응법에 의해 P. mikwangii 지놈 DNA를 각각 400 fg 및 40 fg까지 종-특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었 다(Fig. 2 및 3). P. mikwangii KCOM 1628^T의 세균 지놈 크기가 약 1.5 Mb인 점[11]을 고려하면, B134-F11/ B134-R1 및 B134-F5/B134-R5 프라이머 쌍들은 P. mikwangii를 각 각 약 240 및 24 마리에 해당하는 지놈 DNA까지 검출할 수 있는 민감도가 있음을 의미한다.

본 연구에서 중합효소연쇄반응 프라이머 설계에 사용한 PrimerSelect (DNASTAR Inc.) 프로그램을 이용할 때, 중합효 소연쇄반응 프라이머와 주형 지놈 DNA 간의 최적결합온도 가 자동적으로 제시된다. 하지만, 최적결합온도는 gradient PCR을 실시하여 구할 수 있다[9,12]. 본 연구에서도 PrimerSelect (DNASTAR Inc.)를 이용하여 얻은 B134-F11/B134-R1 및 B134-F5/B134-R5 프라이머 쌍 각각의 최적결합온도는 57.5 및 58.2℃였지만, 실제 최적결합온도는 각각 64℃ 및 68℃였 다(Fig 1). 즉, P. mikwangii와 유전자 수준에서 가장 가까운 Peptoniphilus asaccharolyticus 균주(KCTC 3321^T)의 지놈 DNA를 이용하여 결합온도를 56-70℃ 사이에서 2℃ 간격으 로 중합효소연쇄반응을 실시하여 P. asaccharolyticus KCTC 3321^T 균주 지놈 DNA에서는 증폭물이 보이지 않고, P. mikwangii 균주(KCOM 1628^T) 지놈 DNA에서 생성된 증폭 물들의 밴드 진하기가 동일하게 유지되는 온도 중 가장 높 은 온도를 최종 결합온도로 정하였다.

세균 종-특이성 중합효소연쇄반응 프라이머를 설계하기 위한 표적 유전자자로는 16S rDNA이 가장 많이 사용되고 있다. 그 이유는 16S rDNA는 세균의 종-수준에서 분류를 하는 황금기준 중의 하나이기 때문에 모든 세균 종의 16S rDNA 데이터가 잘 확보되어 있기 때문이다[13].

이상의 연구결과를 요약하면, P. mikwangii 종-특이적으 로 검출하기 위해 개발된 B134-F11/B134-R1 및 B134-F5/ B134-R5 프라이머 쌍들은 종 특이성이 뛰어나며, P. mikwangii 균주를 약 240 및 24 마리까지 검출할 수 있는 민감도를 갖는다는 것이 확인되었다. 이들 프라이머 쌍들은 향 후 구강 내 세균 감염성질환과의 연관성을 밝히는 역학 연구에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 생각된다.