서 론

근관 치료는 근관 성형 및 근관 세척, 근관 소독을 통해 이루어지며 근관 내 세균의 90% 이상이 기구의 기계적인 제거에 의해 이루어진다고 알려져 있다[1,2]. 그러나 잔존 세균이 협부(isthmus), 부근관, 상아세관 등에 남아 치근단 치주염을 일으킬 수 있다[3]. 치료된 치아에서 가장 흔하게 잔존하는 세균 종으로 Enterococcus faecalis가 있으며, 검출 율은 90%에 이른다[4-6]. E. faecalis는 상아 세관으로 깊이 침투할 수 있고 근관에 생체막(biofilm)을 형성할 수 있으 며 영양분 결핍에도 살아남을 수 있고 영양분이 재축적되 면 다시 자랄 수 있다[7-9]. 또한, E. faecalis는 높은 알카리 성 특성을 갖는 수산화칼슘에도 저항할 수 있어 클로르헥 시딘(chlorhexidine), MTAD (mixture of a tetracycline isomer) 등 화학적으로 E. faecalis를 완전하게 제거하기 위한 다양 한 연구가 이루어지고 있다[10-12].

망고스틴(Garcinia mangostana L.)은 인도네시아, 태국, 말 레이시아 같은 동남아시아에서 광범위하게 재배되고 있다 [13]. 망고스틴 내에 포함된 xanthone에 의해 다양한 약리학 적 효과를 나타내며, 항염증작용, 항암작용, 항산화작용, 항 궤양작용, 항균작용을 나타낸다[14,15]. 특히, vancomycin resistant enterococci (VRE)와 methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA)와 같은 항생제 내성을 가진 세균들에게도 큰 항균효과를 가짐이 알려지면서 큰 관심을 받고 있다 [16]. 현재, 망고스틴 과일 껍질에서 순수 분리한 알파-망고 스틴(alpha-mangostin)에 대한 E. faecalis 1 균주(ATCC 29212)에 대한 항균능에 대한 보고가 있었다[17]. 하지만 천연물에서 단일 화합물을 추출하는 것은 산업화하기에는 경제적 및 시간적 제약이 있기 때문에 복합추출물을 사용 하는 것이 경제적이라 생각된다. 그러므로 본 연구에서는 망고스틴 에탄올 추출물에 대한 한국인 구강에서 분리 동 정된 E. faecalis에 대한 항균능을 조사하여 향후 근관세척 제로서의 사용 가능성과 적정 농도를 알아보고자 한다.

재료 및 방법

세균 및 배양

본 연구에 사용된 E. faecalis KCOM 1083, E. faecalis KCOM 1161, E. faecalis KCOM 1162, E. faecalis KCOM 2816 및 E. faecalis KCOM 2823 등은 한국인의 구강에서 분리 동 정된 것으로 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea)에서 분양받아 사용하였 다. 그리고 E. faecalis KCTC 3206^T는 한국생명공학연구원 생 명자원센터(Korean Collection for Type Culture, Daejeon, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 본 연구에 사용된 모든 균 주들은 brain heart infusion (BHI; BD Difco Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA) 배지에 접종하여 37℃ 세균배양기 (Model SW-900C, Sugong, Seoul, Korea)에서 배양하였다.

최소살균농도(minimum bactericidal concentration, MBC) 측정

본 연구에서 사용한 망고스틴 에탄올 추출물(이하 망고 스틴 추출물)은 Savesta 사(Gujarat, India)에 의뢰하여 추출 하였으며, 이들은 alpha-mangostin (41.08%)을 포함한 플라 보노이드(flavonoids)가 96.44% 함유되어 있다. 망고스틴 추 출물은 Dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 녹여서 다음 실험들에 사용하였다.

MBC 측정은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [18]에서 제시한 미세희석(micro-dilution) 법을 변형 하여 사용하였다. 각 세균들을 앞에서 소개한 배지에 접종 하여 37℃에서 24시간 동안 세균배양기에서 배양한 후 1×106 CFU/ml가 되도록 희석하여 96-well plate에 분주하였 다. 그 후 망고스틴 추출물 분말을 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 μg/ml 농도가 되도록 세균 배양액에 첨가하였다. 이때 음성대조 군은 망고스틴 추출물 분말의 용매인 DMSO (Sigma- Aldrich)를 세균배양액에 1%를 첨가한 것으로 하고, 양성 대조군은 ampicillin (Sigma-Aldrich) 최종 농도가 100 μg/ml 가 되도록 세균배양액에 첨가한 것을 사용하였다. 이들을 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 세균배양액은 원액, 1,000 배, 10,000배 희석하여 10 μl를 취하여 한천배지에 도말하 였다. 이를 37℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 형성된 군락 수(colony forming unit; CFU)를 측정하였다. 음성대조군과 비교하여 99.9% 세균이 자라지 않는 최소 농도를 MBC 값 으로 결정하였다. 각 반응은 3회 반복 실시하였다.

세포 독성 실험

본 연구에서 사용한 불멸화된 사람 치은섬유모세포 (immortalized human gingival fibroblast, hTERT-hNOF)는 연세대학교 구강병리학 교실 김진 교수님으로부터 분양 받아 사용하였다. hTERT-hNOF는 DMEM/F-12 (Dulbecco’s Modified Eagles Medium / Nutrient Mixture F-12, 3:1 Mixture, Welgene, Gyeongsan, Korea)에 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA) 및 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)을 혼합한 배지를 이 용하여 37℃, 5% CO2, 100% 습도가 유지되는 CO2 세포 배양기(Model MCO175, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양 하여 다음 실험에 사용하였다.

hTERT-hNOF를 24-well plate에 5 ˟ 10⁴ cells을 계대 배양 한 후 80% confluence 되면, 망고스틴 추출물을 1, 2, 4, 8, 16, 32 μg/ml로 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 이를 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 0.25% Trypsin- EDTA (Welgene, Gyeongsan, Korea)를 첨가하여 세포를 떨 어뜨렸다. 여기에 배지를 첨가하여 세포를 현탁한 후 hemocytometer를 이용하여 현미경하에서 세포수를 세었다. 각 반응은 3회 반복 실시하였다. 그리고 생존한 세포수의 평균 및 표준편차를 계산하고 대조군(1% DMSO)에 대한 백 분율을 산출하였다.

결 과

망고스틴 추출물 8 μg/ml 이상의 농도로 24시간 처리한 실험군에서 본 연구에서 사용된 모든 E. faecalis 균주들에 대한 살균율은 100%이었다(Table 1). 망고스틴 추출물 4 μg/ml 농도에서도 E. faecalis KCTC 3206T 균주(55.6%)를 제외하고는 모두 24시간 처리한 실험군에서 100% 살균율 을 보였다(Table 1).

망고스틴 추출물의 농도에 따른 hTERT-hNOF에 대한 세포 생존율을 측정한 결과, 본 시험에서 사용한 망고스 틴 추출물 16 μg/ml 이하의 농도에서는 hTERT-hNOF 세 포주의 생존율은 대조군에 비해 83.7-89.1%을 보여 세포 독성이 없는 것으로 조사되었다(Fig. 1).

고 찰

연구 결과, 망고스틴 추출물의 E. faecalis 6균주들에 대 한 24시간 배양 후 MBC 값은 한국인에서 분리 동정된 5 균주들에 대해서는 4 μg/ml이었으며, 서양인에서 분리 동 정된 E. faecalis KCTC 3206T 균주에 대해서는 8 μg/ml이었 다. 망고스틴 열매 껍질에서 순수 분리한 alpha-mangostin에 대한 E. faecalis ATCC 29212에 대한 MBC 값은 3.94 μg/ml 로 보고되었다[17]. 본 연구에서 사용한 망고스틴 추출물에 함유된 alpha-mangostin의 농도가 41.08%인 점을 감안하면, 망고스틴 추출물 4 μg/ml에는 alpha-mangostin 1.64 μg/ml이 함유된 것이라 볼 수 있다. 즉, 한국인에서 분리 동정된 5 균주의 E. faecalis는 서양인에서 분리 동정된 균주들(ATCC 29212 및 KCTC 3206^T)에 비해 alpha-mangostin에 대해 감수 성(sensitivity)이 좋은 것은 것으로 조사되었다.

현재, 근관세척제로 주로 사용되는 차아염소산나트륨 (NaOCl)과 클로르헥시딘의 E. faecalis ATCC 29212 균주에 대한 MBC 값은 각각 0.3125% (15.625 mg/ml) 및 0.0005% (0.005 mg/ml)인 것으로 조사되었다[17]. 차아염소산나트륨 과 클로르헥시딘이 근관세척제로서 각광받고 있지만 두 물질을 병행 사용 시 파라클로로아닐린(parachloroaniline) 이라는 적갈색의 침전물이 침전되기 때문에 동시에 사용 하기 어렵다[19]. 또한, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis and Lactobacillus acidophilus 등의 구강 세균들에 대한 망고스 틴의 MBC 값은 E. faecalis 균주에 대한 것에 비해 매우 높 았다[20]. 즉, S. mutans, S. sanguinis, S. salivarius 균주에 대 한 MBC 값은 200 mg/ml, S. oralis 균주에 대해서는 100 mg/ml, L. acidophilus 균주에 대해서는 50 mg/ml로 높게 나 타났다[20]. 결과적으로 근관에 존재하는 모든 종류의 세균 을 사멸시키기 위해 망고스틴을 근관세척제로 이용하기 위해서는 다른 근관세척제와 병용 사용이 필요할 것으로 보인다. 이러한 병용 사용을 위해서는 클로르헥시딘보다 E. faecalis에 대한 감수성도 좋고 침전물을 형성시키지 않 을 차아염소산나트륨과 같이 사용하는 것이 효과적일 것 이라 생각된다.

망고스틴의 hTERT-hNOF에 대한 세포독성 실험의 결과 에 의하면 16 μg/ml 이하의 농도에서는 세포 독성이 없는 것으로 조사되었다(Fig. 1). Alpha-mangostin은 사람정상치 은섬유모세포[21]와 사람치주인대세포[17]에 대한 세포독 성 실험에서도 세포독성이 없다고 보고되었다. 즉, alphamangostin 15.76 μg/ml을 사람치주인대세포에 10분간 적용한 경우에 세포 독성이 존재하지 않았고[17], alpha-mangostin 4,000 μg/ml를 NHGF에 8시간 적용한 경우 세포 독성이 존 재하지 않았다[21]. 하지만, 본 연구에서 망고스틴 추출물 64 μg/ml를 hTERT-hNOF에 24시간 투여한 경우 세포생존 율이 40.1%이었다. 이러한 차이는 망고스틴 추출물에는 alpha-mangostin 이외의 세포 독성을 갖는 화합물이 존재하 기 때문인 것으로 생각된다. 다음 연구에서는 망고스틴 추 출물을 물과 같은 다른 용매를 이용하여 추출한 후에 동일 한 실험이 필요하리라 생각된다.

이러한 연구 결과를 종합할 때, 망고스틴은 근관치료 실 패의 주요한 원인균이라 알려진 E. faecalis에 대한 항균능 이 우수하면서도 치근단 주위 조직에 있는 정상 세포에 대 한 독성이 적어 재근관치료 시 유용한 근관세척제로 사용 가능할 것으로 생각된다.