Introduction

알코올의 섭취는 간, 뇌, 생식소(gonad) 등과 같은 생체 내 여러 장기들에서 다양한 병태를 유발하는 것으로 보 고되고 있다[1]. 음주 시 가장 먼저 알코올에 노출되는 신체 부위는 바로 구강점막으로 지속적인 알코올 섭취가 전신적 질환을 일으킬 뿐만 아니라, 구강점막 및 침샘의 형태적 변화에 의한 침 분비의 장애 유발 가능성이 지속 적으로 제기되고 있다[2-6].

침 (타액, saliva)은 구강 점막을 보호하고 구강 내 윤활 작용을 하며, 항균, 혈액 응고, 산에 대한 완충작용, 소화, 수분대사의 조절, 배설작용 및 용매작용 등 정상적인 구 강 건강 및 기능의 유지에 매우 중요한 역할을 하므로[1] 침 분비량의 저하는 다발성 치아우식증 및 구강조직 질 환 등 구강 건강상태에 직접적인 영향을 미칠 수 있다는 것은 잘 알려져 있다[7, 8].

분비된 침의 성분 중 90% 이상을 차지하고 있는 수분 은 침샘 내 수분통로 단백질인 Aquaporins (AQPs)에 의해 이루어지며, 침샘의 샘꽈리세포(acinar cell)에는 AQPs family 중 AQP5가 주로 분포하고 있는 것으로 알려져 있 다[9, 10]. 이전의 연구들에서 AQP5를 결손 시킨 형질전 환 (transgenic) 생쥐의 귀밑샘과 혀밑샘에서 수분 투과성 감소를 규명하였고, 이를 통하여 AQP5가 샘꽈리세포 세 포막에서 수분 투과성을 조절하는 주요 경로임을 제시하 였다[10, 11].

알코올은 음주 후 수 분 내에 순환계에 진입하여 신체 곳곳에 빠르게 영향을 미치게 된다[12]. 알코올이 침샘에 미치는 영향에 관한 몇몇 연구들은 주로 알코올 중독(만 성적 알코올 섭취)과 관련해서 이루어지고 있으며, 알코 올의 장기간 섭취 시 외분비샘을 포함한 자율신경계가 지배하고 있는 기관들에서 형태/기능적 변화 유발에 대 한 연구가 전부이다[13]. 아직까지 급성 알코올 섭취 및 알코올 섭취량에 따른 침샘에서의 침 분비 기전과 관계 된 연구는 거의 없는 실정이며, 이전 연구에서는 알코올 에 의한 침 분비 감소 원인은 침샘과 관련된 자율신경계 보다는 침샘의 분비세포 내에서의 세포생물학적 변화의 가능성이 높은 것으로 보고 하였다[14].

따라서, 본 연구에서는 사람의 1일 적정 알코올 섭취 량 (기준용량, 40 g/60 kg)을 기준의 1배, 2배 및 4배까지 의 용량을 생쥐에 적용하여 침 분비 변화를 측정하여 알 코올 투여량과 침 분비 간의 상관관계를 확인하였고, 귀 밑샘과 턱밑샘들을 적출하여 침 분비와 직접적으로 관련 된 APQ5의 변화를 확인하고자 하였다.

Materials and Methods

실험동물 (Experimental animals)

본 연구에서는 6주령의 수컷 ICR-mouse를 이용하였다. 각 실험군 마다 7마리 (n =7)씩 사용하였으며, 실험동물 은 정상군 (control)과 ethanol을 4 g/kg, 8 g/kg 및 16 g/kg 의 용량으로 섭취한 군으로 각각 나누었다.

알코올의 처리 (Ethanol treatment)

알코올의 처리는 용질로써 ethanol을 사용하였으며, ethanol을 희석하기 위한 용매로는 증류수를 사용하였다. ethanol의 처리는 WHO 권고 1일 알코올 섭취량인 40 g / 60 kg을 사람 용량에서 동물 용량으로 환산[15]하여 권고 섭취량을 생쥐에서 8 g/kg으로 정하였고 이것의 1/2 및 2배 용량을 적용하였다. 동물의 체중 (평균 25 g)을 고려하여 적용하였으며, feeding needle을 이용하여 0.1 g/ml 농도의 ethanol을 각 실험 군별로 각각 0.5 mL, 1 mL 그리고 2 mL를 위 내에 직접 투여하였다.

타액수집 (Saliva harvest)

타액의 분비량 (Salivation measure)

알코올 투여 1시간 후 침 분비 유도를 위해 pilocarpine (2 mg/kg, i.p)을 복강 내에 주사하였다. 5분 동안 생쥐의 구강 저에 고인 침을 마이크로 피펫을 이용하여 수집하였다.

타액의 점조도 (saliva viscosity)

수집된 침으로 군별로 100 ㎕씩 45˚의 기울기 유리에 서 흘려서 도착지점 (20 cm)까지의 시간 (min)을 재어 점 조도를 측정하였다.

조직 처리 (Tissue process)

본 연구에서 보다 정확한 결과를 얻기 위하여 실험동 물의 조직은 동일한 조건 하에서 처리하였다. 조직학적 분석을 위하여 침 분비 측정이 끝난 후 즉시 실험동물의 흉곽을 개방하여 관류 고정 후 턱밑샘과 귀밑샘을 신속 하게 적출하여 고정액에 6시간 고정한 뒤 통상적인 방법 에 따라 파라핀 블록을 제작하였다. 제작된 블록은 절편 화 하여 조직 염색에 이용하였다.

침샘조직 분석방법 (Tissue analysis)

Hematoxyline/eosin 염색

조직은 통상적인 탈파라핀 함수과정을 거쳐 염색에 이용 하였다. 함수가 끝난 조직은 증류수에 10분간 세척하였다. 이 조직은 Harris hematoxylin 용액에 8분간 염색한 후에, 흐르는 물에 염료가 더 이상 나오지 않을 때까지 세척하고, 1% acid alcohol 용액에 10회가량 침적하였다. 다시 흐르는 물에 세척한 후 0.5% ammonia water에 10회가량 침적한 후 다시 흐르는 물에 세척 하였다. 세척이 끝난 조직은 eosine 용액에 1분간 염색한 다음 70%, 80%, 95% ethanol에 각각 1번씩 2분간 거치고 100% ethanol에 2분씩 2회 거친 후 xylen으로 옮겨 2분씩 3회 거쳐 canada balsam (Kato, Japan) 으로 봉입하였다.

면역조직화학염색 (Immunohistochemistry)

조직은 통상적인 탈파라핀 및 함수과정을 거쳐 염색에 이용하였다. 함수가 끝난 조직은 pH 6.0 citrate buffer에서 microwave를 이용하여 15분간 항원 노출 (antigen retrieval) 을 진행하였다. 이후 0.3% 과산화수소 (H₂O₂)가 들어있는 PBS 용액으로 30분간 처리한 후 10% normal goat serum이 들어있는 0.01 M PBS에 30분간 처리하였다. 처리가 끝난 조직은, Anti-goat aquaporin5 (AQP5, diluted 1:250, Santa crus Bio. USA)에서 2일간 반응시켰다. 반응이 끝난 조직은 biotinylated goat anti-goat (diluted 1:250, Vector, USA)와 반응 시킨 후 ABC complex (diluted 1:200, Vector, USA)에 차례로 반응시켰다. 반응이 끝난 조직은 0.05% 3, 3-diaminobenzidine (0.1 M Tris-HCl buffer, pH 7.2)에서 발색한 후 슬라이드에 도말 한 후 탈수 청명화 과정을 거쳐 Canada balsam (Kato, Japan)으로 봉입하였다.

단백질 정량 (Western blot)

실험동물의 침샘 조직을 300 ul 용해 완충액 (lysis buffer; pH 7.5, containing 137 mM NaCl, 20 mM Tirs-HCl, 1% Tween 20, 10% glycerol, 1 mM phenylMethyl-sulfonyl fluoride, and protease inhibitor cocktail)으로 30분 동안 0℃에서 균질화 (homogenization) 시켰다. 각 표본을 Ultrasonicator를 이용하 여 세포를 파괴시켜 원심분리 (15,000 rpm, 4℃, 30분)하고, 상층액을 재차 원심분리 하였다 (15,000 rpm, 4℃, 30분). 5분 동안 열판에서 가열한 후, 전기영동을 위해 단백질 농 도를 Bio-rad dye-binding microassay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 결정하고, 70 ug의 단백질을 12% polyacrylamid gel 로 전기영동 시킨 후 단백질들을 니트로셀룰로오스막에 옮 겼다. 일차 항체로 Anti-goat AQP5 (Santa crus Bio. USA) 항체를 이용하였다. 이차 항체는 일차 항체에 따라 anti-goat antibody (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 실온에서 1시간 동안 함께 반응시켰다. 염색된 단백질을 ECL kit을 이용하여 발생하여 발현 여부를 확인하고, β-actin을 대조 군으로 하여 각 단백질들의 변화를 비교하였다.

자료분석 및 통계처리

Ethanol 처리 군에서 침 분비 감소를 확인하기 위하여 측정된 침의 분비량을 측정하였다. 또한, 침 분비 감소와 관련된 단백질 및 항산화 단백질 변화를 확인하기 위하여 western blot을 이용하여 단백질을 정량하였다. 정량된 밴드 는 스캔 후 Image J (software: NIH, USA)를 이용하여 수치화 하였다. 침 분비율은 분당 분비된 침의 양 (mg/min)의 평균 으로, 단백질 정량 수치는 정상 실험군에 대한 상대적인 값의 평균으로 표시하였다. 각 실험군 간의 값의 차이는 SPSS 프로그램을 이용한 two-way ANOVA 및 Tukey test를 이용하여 통계학적으로 분석하였으며, 통계학적으로 p 값 이 0.05 이하면 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다. 본 연구에 표시된 값은 평균치±표준오차 (standard error of measurement, SEM)으로 표시하였다.

Result

타액의 유속 및 점조도

정상군에서 pilicapine에 자극된 침 분비는 분당 0.88 ± 0.13 mg/min의 분비가 관찰되었으며, 4 g/kg ethanol 군에 서는 분비가 급격하게 감소하여 분당 0.54 ± 0.15 mg/min 의 타액 분비가 관찰되었다. 8 g/kg 및 16 g/kg ethanol 군 에서도 정상군과 비교하여 타액 분비가 유의성 있는 감 소가 나타났으나, 4 g/kg ethanol 군에 비교하였을 때에 알코올의 투여 농도에 따른 유의성 있는 차이는 없었다 (Fig. 1A).

타액의 점조도는 정상군과 비교하였을 때 모든 알코올 섭취 군에서 증가하는 경향을 보였으며, 섭취 알코올의 용량에 따라 증가하였다 (Fig. 1B).

Hematoxylin & Eosin staining (H&E staining )

정상군의 귀밑샘에서는 피라미드 형태의 분비세포 (secretory cells)로 이루어진 샘꽈리(acinus)와 샘꽈리 사이 에 위치한 도관(ducts)이 (Fig. 2A) 그리고 턱밑샘에서는 장액샘세포와 점액샘세포로 구성된 두 가지 샘꽈리 및 그 사이의 도관들이 정상적인 형태를 띠고 있었다 (Fig. 2E). 알코올을 투여한 모든 실험군의 귀밑샘과 턱밑샘에 서 침샘세포의 사멸(cell death), 섬유화(fibrosis) 또는 지 방변성(apodiposis)과 같은 침샘 세포의 손상과 관련된 병 리학적 소견은 관찰되지 않았다 (Fig 3B-3D, 3F-3H).

AQP5 면역조직화학 및 단백질 발현 변화

침의 분비량에 가장 큰 영향을 미치는 수분의 분비 통 로인 AQP5가 알코올 섭취에 의하여 어떻게 변화하는지 확인하기 위해 AQP5 항체를 이용하여 귀밑샘과 턱밑샘 에서 면역조직화학염색 및 단백질 정량을 수행하였다.

귀밑샘의 경우 AQP5 면역조직화학염색 결과, 정상군의 귀밑샘에서는 AQP5 면역반응이 대부분의 샘꽈리 내 장액 세포에서 관찰되었다. 특히 이러한 면역반응은 샘꽈리세포 의 내강 쪽 부분인 세포질 및 꼭대기 쪽 세포막에서 발견되 었으며 세포질보다 꼭대기 쪽 세포막에서 강하게 관찰되었 다 (Fig. 3A). AQP5 면역반응은 알코올 섭취 군에서도 관찰 되었는데 정상군과 마찬가지로 샘꽈리세포의 꼭대기 쪽 세 포막에서 주로 면역반응을 나타냈었으나, 알코올 투여군에 서 모두 세포질에서의 AQP5의 면역 반응성은 확연하게 감 소하였다 (Fig. 3B-3D). 턱밑샘의 경우에도 귀밑샘과 마찬 가지로 정상군의 장액샘꽈리 내 장액세포의 세포질 및 꼭 대기 쪽 세포막에서 AQP5 면역반응이 확인되었다 (Fig. 4A). 알코올 섭취 군에서도 AQP5 면역반응은 장액샘꽈리 의 장액세포의 세포질에서 감소하는 경향을 보였으며, 실 험 군간 면역반응의 차이를 보였다 (Fig. 4B-4D).

AQP5 단백질 발현량을 비교하기 위하여 Western blot을 통하여 AQP5 단백질을 정량한 결과에서는 귀밑샘에서 정 상군과 비교하였을 때 4 g/kg ethanol 군 30.0%, 8 g/kg ethanol 군 66.1%, 16 g/kg ethanol군 75.1%의 AQP5 발현이 감소하여 알코올 섭취 용량에 따른 AQP5 발현 감소가 확인되었다 (Fig. 3E). 턱밑샘의 경우에는 정상군 대비 4 g/kg ethanol 군 19.9%, 8 g/kg ethanol 군 32%, 16 g/kg ethanol 군 69.2%의 AQP5 발현 감소가 나타났다 (Fig. 4E). 턱밑샘의 경우 귀밑 샘보다 알코올 섭취에 의한 AQP5 발현 감소의 폭은 작았지 만, 알코올 섭취량에 비례하여 AQP5의 발현이 감소하였다.

Discussion

술의 주성분인 ethanol은 섭취 시 신체에 다양한 조직 에 영향을 미치며 이와 동시에 다양한 질병을 유발하게 된다[16]. 특히, ethanol은 구강 조직을 쉽고, 빠르게 투과 하는 특성 때문에, 알코올 섭취 후 침에 포함된 ethanol 농도가 혈장보다 높아지는 것으로 알려져 있다[17, 18]. 이것은 침샘이 구강 내 부속기관으로써 알코올 섭취 시 쉽게 영향을 받을 수 있다는 것을 의미한다.

본 연구에서는 용량별 급성 알코올 섭취에 따라 침 분비 감소가 관찰되었으나, 투여 용량별 유의성 있는 침 분비 감소는 나타나지 않았다. 이전의 사람을 대상으로 한 연구 들은 적당한 알코올의 섭취는 귀밑샘의 침 분비를 자극하 지만[13], 다량의 알코올 섭취는 오히려 귀밑샘 침 분비를 억제한다고 보고하였다[19]. Dutta 등[20]은 사람에서 과량 의 알코올 섭취에 의해 혈중알코올농도가 1.0%인 경우 귀 밑샘 침 분비가 50%가량 감소한다고 하였으며, Martin 등 [13] 및 Winsor 등[19]의 연구에서도 유사한 결과를 제시한 바 있다. 흰쥐를 이용한 연구들에서는 고농도의 급성 알코 올 섭취가 침의 분비감소, 단백질합성 억제, 전해질의 불균 형 등의 결과를 일으킨다고 보고된 바 있다[21-23]. 이전의 알코올 섭취 후의 침 분비 감소에 대한 연구가 알코올의 섭취 기간, 침 분비 자극 시점 및 방식이 다르기는 하지만 대부분 알코올의 섭취 이후 침 분비의 감소를 초래하였다. 본 연구에서는 4 ~ 16 g/kg ethanol을 적용하였으며 이전의 고농도 ethanol 투여 연구 결과와 동일한 결과를 보여 주었 다. 본 연구에서 ethanol의 투여경로는 위 내 투여를 이용하 였다. 동물 실험의 특성 상 위 내 ethanol을 직접 투여하는 방식이 사람에서 ethanol 섭취 시 구강점막으로도 ethanol이 흡수될 수 있는 상황을 재현하지 못한 점은 본 연구의 한계 점이라고 할 수 있다. 하지만, WHO 1일 알코올 섭취 권장 량 절반 가량의 ethanol을 위 내 투한 경우에도 침 분비가 감소하여 이전의 적당한 알코올 섭취가 침 분비를 자극한 다는 연구결과와 배치되었으며[13], 이와 같은 결과는 적은 양의 ethanol을 1회 섭취하더라도 단시간 내 침 분비 감소가 유발될 수 있으므로 음주 시 특히 구강 관리에 주의를 기울 일 필요가 있음을 시사한다.

침의 점조도의 경우 알코올 투여량 증가에 비례하여 증가하였다. 침의 점조도는 분비량과 밀접한 관련이 있 으며, 일반적으로 침의 분비량이 감소와 침의 점조도 증 가는 높은 상관관계를 가지고 있는 것마으로 알려져 있 다[24]. 본 연구결과에서 알코올 용량 증가 투여에 따른 침 점조도 증가는 알코올 투여량에 따른 침 분비 감소량 과 다소 다른 패턴을 나타내었다. 이와 같은 결과는 알코 올 섭취에 의한 점조도 증가는 단순히 침 성분 중 수분 감소에 의한 것이 아니라는 점을 나타낸다.

본 연구에서는 급성 알코올 투여에 따른 침 분비 저하 원인을 확인하기 위하여 귀밑샘 및 턱밑샘의 형태학적 변 화 및 수분분비단백질 (AQP5)의 변화를 확인하였다. 이전 의 장기간 알코올 섭취 연구에서는 침샘의 형태와 기능 자 체에 영향을 미칠 수 있다는 보고가 있었으며, 이는 알코올 의 섭취가 침샘의 위축, 단백질 구성의 감소 및 침 분비 감소의 원인임을 제시한 바 있다. 하지만, 본 연구에서 급성 알코올 투여에 따른 귀밑샘 및 턱밑샘에서의 병리 소견은 발견되지 않았다. 이와 같은 결과는 본 연구에서 제시한 알코올 농도의 급성 투여에 의한 침 분비 저하는 침샘의 손상과 연관성이 없다는 것을 의미한다.

한편, 침 분비량에 가장 중요한 것은 수분의 양인데 침 분비 시 수분은 수분통로 단백질을 통하여 샘꽈리 세포 에서 도관으로 분비된다는 가설이 가장 유력한 것으로 알려져 있다. 생쥐의 경우 침샘에 AQP1, AQP4, AQP5 및 AQP8의 존재가 확인되었다. AQP5의 knock-out mice의 경우 야생형과 비교하여 60%가량의 자극 침 분비 저하 및 점조도 증가가 있었으나 AQP1, AQP4 및 AQP8 knock-out mice에서는 침 분비량 변화가 없다는 연구를 통하여 AQP5가 침샘에서 수분 분비 및 점조도 조절에 중요한 단백질임이 밝혀졌다[10]. AQP5는 아세틸콜린에 대한 반응으로 세포질 내 소포에서 세포막으로 이동하여 작용하게 된다[25,26]. 본 연구결과 귀밑샘과 턱밑샘에서 모두 AQP5의 발현이 알코올의 섭취에 의하여 감소하였 다. 정상적인 AQP5의 분포는 두 침샘 모두에서 세포질 그리고 장액샘 꽈리내의 장액샘 꼭대기 쪽 세포막에서 되었으며, 이와 같은 결과는 이전의 흰쥐[27], 양[28] 및 사람[29] 등의 침샘조직에서 AQP5 면역조직화학염색 결 과와 일치한다. 귀밑샘과 턱밑샘 모두 AQP5 면역반응은 알코올 섭취량에 따라 점점 감소하였는데, 정확한 단백 질의 양적 변화의 확인을 위한 AQP5 정량결과 4 g/kg ethanol 군에서 AQP5 발현의 감소가 나타났으며 그 이상 농도의 알코올 섭취 군에서도 모두 AQP5 발현이 감소하 는 경향을 나타냈다. 알코올의 용량에 비례한 AQP5 단 백질의 발현 감소는 나타나지 않았지만 모든 실험 군에 서 정상 군과 비교하였을 때 AQP5 단백질이 감소하였으 며, 이와 같은 현상은 두 침샘 모두 장액샘꽈리의 세포에 서 나타났는데, 노화 시 침의 분비 저하 원인으로 AQP5 발현의 감소가 지목된 이전 연구 결과를 고려하였을 때 [30] 본 연구에서 ethanol의 섭취에 의한 침 분비량 저하 또한 ethanol 섭취에 의한 AQP5 발현 저하와 밀접한 연 관성이 있음을 의미한다.

이상을 종합해 보면 알코올 농도에 따른 침샘에서의 침 분비 감소는 수분이동 통로의 주 역할을 하는 AQP5 의 감소와도 깊은 연관성이 있는 것으로 사료된다. 본 연 구는 침 분비에 있어서 알코올의 섭취 시 수분 배출 관 련 단백질의 발현 수준의 연구였기 때문에 보다 정확한 기전의 확인을 위해서는 알코올의 섭취에 따른 AQP5 상 위 세포 신호체계에 대한 연구를 제안하는 바이다.