Introduction

인류의 기대수명이 늘어나면서 골다공증 유병률이 높아지고 있으 며 특히 폐경기 이후 여성에서 호르몬 감소로 인한 골다공증의 유병률 이 증가하게 되어 다양한 방법으로 이를 치료하고자 노력해 왔다[1]. 골 다공증은 낮은 골 질량 및 골조직 내 미세구조의 파괴로 인해 나타나 는 골의 취약함과 이로 인한 골절 발생의 증가를 주요한 특징으로 가 지는 전신질환이다. 치료는 임상적 골절의 확률을 낮추는 것을 목적으 로 하며 bisphosphonate계열이 일차 치료 약물로 선택되어 왔다[2]. Bisphosphonate는 주로 골의 흡수를 막기 위해 파골세포의 분화와 활 성을 낮추고 apoptosis를 유도하는 역할을 한다[3]. 이외에도 (receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand) RANKL inhibitor, selective estrogen-receptor modulators (SERMs), 부갑상선 호 르몬 등이 치료제로 사용되고 있다[2]. 그러나 bisphosphonate와 RANKL inhibitor가 골다공증 치료제로 인한 약물 관련 골괴사 (medication related osteonecrosis)의 주요 원인으로 밝혀졌으며 부갑상선 호르몬의 경우 높은 비용, 매일 주사를 해야 하는 번거로움과 골육종 발 생가능성 등으로 널리 이용되지 못하고 있다[3,4].

조골세포는 중간엽 줄기세포에서 유래하는 세포로 골조직 형성에 연 관된 다양한 성장인자와 cytokine, 호르몬에 의해 분화 및 활성이 조절 되는 세포이다[5]. 조골세포의 분화의 자극을 활성화하는 물질은 골소 실량을 회복시키고 해면골의 미세구조를 개선하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다[6,7]. 중간엽 줄기세포는 다양한 세포로 분화할 수 있으며 분화의 방향은 master transcriptional regulators에 의해 결정된다. 조골세포의 경우는 Runt-related transcription factor 2 (Runx2)가 그 역할을 하며 osteopontin, bone sialoprotein, osteocalcin (OC), osteoprotegerin, RANKL 등의 유전자를 목표로 한다[8,9]. 골형성단 백질 (bone morphogenetic protein, BMP)은 골형성에 중요한 역할 을 하는 cytokine으로 BMP2와 BMP4가 주로 골형성에 기여한다[10]. BMP2는 세포막 receptor에 결합해 SMADs (SMAD1, SMAD5, SMAD8)를 인산화시키고 이들은 SMAD4와 결합한다. 이 복합체는 핵 내로 이동하여 전사를 조절 하게 되며 Runx2 와 Osterix의 활성을 조 절해 조골세포의 분화에 기여한다[11]. Bone sialoprotein (BSP)은 small integrin-binding ligand, N-linked glycoprotein (SIBLING) family에 속하며 골내 콜라겐 성분을 제외한 단백질의 8–12%를 구성 한다. BSP의 발현은 matrix의 초기 mineralization과 같이 일어나며 골 형성 중에 최대 농도에 이른다[12]. Alkaline phosphatase (ALP) 와 OC는 bone matrix를 이루는 단백질이다. ALP는 조골세포 분화 초 기에 extracellular matrix로 분비되며 OC는 분화가 완료되는 시점에 서 분비가 된다.

Berberine은 황련, 황백을 포함한 다양한 약초에서 발견되는 자연 isoquinoline 알칼로이드이다[13]. 이 물질은 항생, 감염 억제, 항암, apoptosis 유도 등의 다양한 약리적 효과를 가지는 것으로 보고되었다 [14]. 또한 Berberine을 포함한 약초가 골다공증을 억제하는 것으로 알 려져 전통 약제로도 사용되어 왔다. 이에 기반으로 다양한 연구가 진행 되었고 파골세포를 억제하여 골다공증을 개선하는 효과를 가지고 있으 며 조골세포의 분화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다[14-17]. 하지만 berberine은 기존의 골다공증 치료제와 비슷하거나 우수한 효과를 보이지 않았기 때문에 berberine을 기반으로 한 새로운 약물의 개발이 필요하 였다.

본 연구에서는 berberine의 구조를 일부 변경한 여러 가지 화합물 사 용하였다. 선별과정을 거쳐 그 효과를 평가한 후 가장 나은 결과를 보인 compound 2b를 선택하였고 이물질이 가지는 효과를 밝히고자 하였 다.

Materials and Methods

1. 세포 배양과 조골세포 분화 유도

쥐에서 유래한 예비근원세포인 C2C12 (ATCC, Rockville, MD, USA)는 37℃, 5% CO2 배양기에서 10% fetal bovine serum (FBS; Welgene, Gyeongsan, Korea)과 1% antibiotic-antimycotic (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 항생제가 포 함된 Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM; Gibco, Waltham, MA, USA)을 사용하여 배양하였다. 조골세포 분화 유도를 위해 세포가 플레이트를 가득 채울 때까지 배양한 후 같은 배지를 사용 하되 BMP2 (500 ng/mL)를 추가로 처리하였다.

2. 항체와 시약

α-tubulin 항체 (sc-53646; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), Anti-Runx2 항체 (ab76956; Abcam, Cambridge, UK), 가 사용되었다. Berberine 유도체 화합물 (compound 1a-3c)은 기존 에 보고된 바와 같이 합성하였다[18]. Recombinant human BMP2 는 Bioalpha Inc. (Seongnam, Korea)에서 구입하였다. WJCPR5는 DMSO를 용매로 사용하였고 모든 음성대조군에는 0.1%의 DMSO가 사용되었다.

3. Alkaline phosphatase 염색 및 분석

분화된 C2C12세포를 4% formaldehyde를 사용하여 5분간 고정한 후 BCIP/NBT color development substrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 ALP 활성을 측정하였다. 정량적 분석은 DMSO에 녹인 시편의 480 nm 파장 흡광도를 이용하여 측정하였다.

4. 일시적 형질주입과 발광효소 분석법

형질주입은 polyethyleneimine (PEI; Polysciences, Warrington, PA, USA)를 이용하였다. DNA는 각 well 당 0.5 μg이 사용되었다. C2C12 세포는 24-well plate에 형질주입 하루 전 well 당 2 × 104 개 수로 배양하였다. 세포는 CMV promoter-driven β-galactosidase reporter, luciferase reporter와 표시된 플라스미드의 조합으로 형질 주입하였다. 24시간 뒤 표시된 시약을 처리한 뒤 활성을 측정하기 위해 Luciferase Reporter Assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하였다.

5. 웨스턴 블롯

6 well plate 의 세포를 phosphate-buffered saline을 이용하여 세 척 후 차가운 상태를 유지하며 RIPA lysis buffer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 20분간 세포를 용해 하였다. 4℃에 서 13,200 rpm 으로 원심분리 하여 얻은 세포 추출물을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) 를 이용하여 분리 후 polyvinylidene fluoride 막에 blot 하였 다. 막을 StartingBlock T20 Blocking buffer (Thermo Fisher Scientific) 를 이용하여 blocking 한 후 tris buffered saline buffer with Tween 20으로 씻어 내었다. 일차 항체를 넣고 반응시킨 후 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated 2차 항체를 반응시켰다. 이후 Western Chemiluminescent HRP Substrate (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용해 enhanced chemiluminescence 기 법으로 시각화 하였다.

6. 세포 독성 측정

화합물의 세포독성을 확인하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 사용하였 다. 20 μL MTT (5 mg/mL) 용액을 96 well plate 에 각각 넣어 최종 농도를 500 μg/mL로 맞추었다. 4시간을 배양시킨 다음 각 well 마다 상층액을 제거 후 isopropanol (100 μL)을 넣어 MTT 결정을 녹여 내 었다. 정량적 분석은 490 nm 파장 흡광도를 이용하여 측정하였다.

7. 통계분석

통계분석은 GraphPad Prism 5.03 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 이용하였다. 자료는 one-way 혹 은 two-way ANOVA 분석을 시행하였다. 결과는 평균 ± 표준편차 (standard deviation)로 표시하였고 p-value는 0.05 미만일 때 통계 적 유의성을 가지는 것으로 판단하였다.

Results

1. Berberine 유도체들의 alkaline phosphatase 염색 결과

여러가지 Berberine 유도체들의 효과를 평가하기 위해 ALP 염색을 시행하였다. ALP는 조골세포분화 초기 단계에서 발현되는 골형성 표지 자이다. BMP2 (500 ng/ mL)를 처리하지 않은 세포를 대조군으로 하 여 C2C12 cell에 BMP2와 유도체들을 처리하여 효과를 검증하였다. Compound 2a, 2b, 3b가 상대적으로 높은 ALP 활성을 보여주었고 (Fig. 1A), 정량적으로 분석한 결과 Compound 2b가 가장 높은 활성 을 보여주었다(Fig. 1B). 또한 berberine 과 Compound 2b를 비교하 였을 때 BMP2 만 사용한 대조군에 비해 berberine, compound 2b 각각 통계적 유의성을 보였으며 2b는 berberine에 비해 약 2배 높은 ALP 활성을 보여주었다(Fig. 1C).

2. Alkaline phosphatase 염색 결과를 통한 berberine 유도 체들의 구조와 활성 관계 분석

위에서 진행한 실험 결과를 토대로 조골세포 분화능 조절과 관련 된 구조 활성 상관관계 (structure and activity relationship, SAR) 연구를 시행하였다(Table 1). 5번 탄소 (C5)와 7번 탄소 (C7)사이에 methylene bridge를 도입한 화합물들 (1a vs. 2a, 1b vs. 2b, 3a vs. 3b)은 대체로 조골세포 분화능이 증가하는 경향을 보였다. 또한 A고리 의 10번 탄소 (C10)나 11번 탄소 (C11)에 methyl기를 한 개 이상 도 입한 화합물은 아무것도 치환되지 않는 화합물보다 좋은 효능을 보였 다. 하지만 C고리의 2번 탄소 (C2)와 3번 탄소 (C3)에 methylene dioxyl기를 도입할 경우 효능이 다소 감소하거나 비슷하게 나타났다(2a, 172.5%와 2d, 166.1%). 이상 실험을 통해 효능을 확인한 화합물 중, 5번 탄소 (C5)와 7번 탄소 (C7) 사이에 methylene bridge를 가지며 A고리의 10번 탄소 (C10)와 11번 탄소 (C11)에 methyl기를 가지는 compound 2b가 가장 높은 ALP 활성 효능 (520%)을 보였으며, 조골 세포 분화능이 우수하다고 판단되어 추가 실험은 compound 2b를 이 용하여 진행하였다.

3. Compound 2b 가 조골세포 분화에 미치는 영향

Compound 2b 가 C2C12 세포의 조골세포로의 분화에 미치는 영 향을 평가하고자 여러가지 농도에서 ALP 염색을 시행하였다. 24 well plate에 C2C12 세포를 배양하여 BMP2 (500 ng/mL)와 함께 약물 을 처리하였다. ALP 염색 후 현미경상에서 관찰한 결과, compound 2b의 농도에 따라서 ALP 발현이 증가하는 양상을 보였다(Fig. 2A). DMSO에 염색을 녹여 정량한 결과에서도 유사한 양상을 보여주었으며 특히 5 μM과 25 μM 농도에서 통계적 유의성을 나타내었다(Fig. 2B).

4. C2C12 세포에 대한 세포독성 평가

MTT를 이용한 세포 독성 실험을 시행하였다. 여러 농도의 약물을 각 각 24시간, 48시간동안 배양하여 처리하였으며 약물의 농도가 증가함 에 따라서 약간의 독성이 나타나는 경향을 보였다. 그러나 효능 확인을 위해서 실험에 사용한 가장 높은 농도인 25 μM에서는 대조군에 비해 통계적 유의성이 없이 비슷한 생존율을 보였다(Fig. 2C).

5. Compound 2b 가 조골세포 분화 전사 인자에 미치는 영향

전사에 주는 영향을 확인하기 위해 대표적인 전사 인자인 Runx2에 대해서 Western blot을 시행하였다. Anti-Runx2 항체를 사용하였고 대조군으로 α-tubulin 항체를 이용하였다. Runx2의 경우는 BMP2를 적용한 경우 양이 증가하였으며 compound 2b와는 관련 없이 일정한 양을 보여주었다(Fig. 3A).

6. Compound 2b 가 골형성 표지자 전사 활성에 미치는 영향

BMP2로 유도된 전사 활성에 compound 2b가 미치는 영향을 확인 하였다. ALP-Luc, BSP-Luc, OC-Luc 리포터 프로모터는 각각 골형 성 표지자인 ALP, BSP, OC의 regulatory sequence를 가지고 있다. ALP, BSP, OC 모두 농도에 따라 전사 활성이 증가하는 양상을 보여주 었다(Fig. 3B).

Discussion

골다공증은 골의 생성과 흡수 사이의 불균형에서 오는 대사성 질환으 로 골절의 위험을 증가시켜 삶의 질을 감소시키는 질환이다. 노령인구 의 증가와 함께 유병률의 상승을 보이고 있으며 이를 치료하기 위해 많 은 노력을 기울이고 있다. 최근 약물의 개발에 있어 빠른 발전을 이루었 으나 현재 치료방법들은 효능과 안전성에 있어서 약간의 한계점들을 지 니고 있다. 여성호르몬 대체 요법은 유방암과 심장질환을 포함하는 몇 몇 부작용을 보이며[19,20] SERMs는 척추 골절에만 효과를 나타내 고 혈전색전증의 확률을 높인다[21-23]. 부갑상선 호르몬 유사체는 매 일 주사를 해야 하는 번거로움과 중단 후 빠르게 효과가 감소하는 특성 을 보이며 골육종 발생 가능성이 존재한다[24]. Bisphosphonate 계열 의 약물 및 RANKL inhibitor의 경우 이를 오랫동안 복용한 경우 bone turnover 감소가 원인으로 생각되는 악골 골괴사와 비정형적 골절이 일 어나는 것이 보고되었다[3,25-27].

우리는 berberine의 합성물을 이용하여 bone turnover를 줄이는 기 존의 bisphosphonate 계열의 약물과는 다르게 골형성을 촉진시키는 anabolic agent로서의 역할을 확인하고자 하였다. Berberine을 질병 치료를 목적으로 한 임상 치료에 대한 연구는 예전부터 계속되어 왔지 만 최근 골다공증 치료를 위한 파골세포와 조골세포에 대한 연구와 인 슐린 감수성 및 비만과 관련된 지방세포 분화 조절에 관한 연구가 많 이 진행되었다[16,17,28]. Berberine은 RANKL에 의해 유도되는 NF-κB와 Akt 활성화를 억제하여 파골 세포의 형성 및 생존을 억제하 였으며, MC3T3-E1 세포를 이용한 조골세포에 대한 효능 실험에서도 Runx2와 p38 mitogen-activated protein kinase 경로에 대한 활성 효과를 보였으며 쥐의 두개골을 이용한 동물실험에서도 조골세포의 분 화를 유도하여 새로운 뼈의 형성을 촉진하는 효과를 나타냈다[29]. 이 러한 유효한 효과에도 불구하고 berberine이 골다공증 치료제로 개발 되지 못한 것은 기존의 골다공증 치료제인 bisphosphonate 계열의 약 물에 비해 치료효과가 높지 않았기 때문이다. 따라서 berberine의 구조 를 기반으로 한 많은 유도체들을 합성하여 효능을 개선하기 위한 연구 가 추가 진행되었으며 이는 C2C12 세포를 이용한 조골세포 분화 확인 실험을 통해 확인하였다. C2C12는 premyoblast 세포로 알려져 있지 만, 근육세포뿐만 아니라 조골세포로 분화능을 가지고 있는 preosteoblasts 세포로 BMP2, BMP4 신호에 의한 조골세포 분화를 측정할 수 있는 우수한 세포주이다[30].

Berberine의 bioisostere인 Q8 화합물은 조골세포 분화의 중요한 전사 인자로 대표적인 Runx2와 Osterix의 단백질 수준을 안정화시키 면서 조골세포의, 분화를 증가시키며, 골다공증 치료제로서 가능성을 보였다[31]. 또한 간엽줄기세포의 분화는 다양한 신호와 전사인자들의 발현 양상에 따라 조골세포, 근육세포, 연골세포, 또는 지방세포 등으로 나눠지며, 특히 지방세포와 조골세포의 분화는 반대 양상으로 나타나 는 것으로 잘 알려져 있다[32,33]. 이러한 측면에서 berberine과 그 유 도체의 지방세포 분화를 억제하는 효능은 조골세포의 분화 촉진에 대한 가능성과 골다공증 치료제로서 개발의 가능성에 힘을 실어 준다. 본 연 구에서는 다양한 berberine의 유도체 화합물을 이용하여 대표적인 조 골세포 분화 인자로 알려진 ALP 염색을 통해서 효능을 측정하였다. 다 양한 구조의 화합물 중에서 4개의 고리 구조를 가지며 4번 고리에 2개 의 methyl기를 갖는 compound 2b가 가장 우수한 효능을 보였다. 다 른 화합물에 비해 compound 2b가 우수한 효능을 갖는 이유를 정확하 게 설명하기 위해서는 표적단백질을 찾고 그에 대한 docking model 이나 3차 구조 모델링을 통해 추가로 확인할 필요가 있다. Berberine 과 비교했을 때에도 약 2.5배의 높은 효능을 나타냈으며(Fig. 1C), 농 도 의존적으로 화합물의 효능이 증가되는 유의적인 결과를 보였다 (Fig. 2A and 2B). 반면 세부적인 작용 기전에 대한 연구 결과를 보면, compound 2b는 다양한 조골세포 분화 표지자로 알려진 ALP, BSP, osteocalcin의 전사 활성을 높였다(Fig. 3B). 하지만 우리의 예상과 는 다르게 중요한 전사 인자인 Runx2의 단백질의 수준을 변화시키지 는 않았다(Fig. 3A). 아마도 compound 2b는 Runx2의 단백질 안정화 를 통해서 활성을 조절하는 것이 아니라 다른 기전을 통해 나타나는 것 으로 보인다. 첫 번째 가능성은 인산화를 통한 Runx2의 활성 조절이 다. 기존 연구 결과에 의하면, Runx2의 인산화는 후성 유전학 측면에 서 염색체의 아세틸화를 증가시켜 조골세포 분화를 유도하는 다양한 유 전자들의 발현을 증가시키는데 필요한 요소이다[34,35]. 두 번째 가능 성은 SMAD 신호를 통한 활성 조절이다. TGF-β/BMP 신호는 조골세 포 분화에 있어 Wnt 신호와 함께 가장 중요한 신호전달 체계로 다양한 SMAD를 활성화시키면서 이루어진다[36]. 본 연구에서 BMP2 신호 에 compound 2b의 효능이 나타난 것을 보면 compound 2b화합물 이 SMAD 단백질의 활성에 영향을 미쳐 조골세포 분화능을 높일 가능 성이 있다. 또 다른 가능성은 Runx2가 아닌 다른 조골세포 인자에 대한 영향으로 Osterix, Msx, Dlx, DKK 등의 유전자 발현이나 안정성, 활성 등에 영향을 줄 수도 있다. 골다공증 치료제로서 compound 2b의 개 발 가능성에 대해 입증하기 위해서는 더욱 자세한 작용 기전에 대한 연 구와 동물 실험 모델을 통한 in vivo 연구가 필요하며 약동학적 특성 및 독성 평가가 필요할 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고 본 연구가 가지 는 의미는, 기존의 유효한 조골세포 분화능력을 가진 berberine과 비교 하여 더욱 우수한 효능을 가진 새로운 유도 물질을 발굴하였으며 그 가 능성을 제시했다는데 있다.