Introduction
Fusobacterium nucleatum은 그람 음성이면서 절대 혐기성인 방추 형(fusiforme) 세균으로, 구강에서 생체막(biofilm) 형성 및 치주질환 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[1,2]. F. nucleatum은 DNA-DNA hybridization (DDH)과 세균 전체 단백질의 폴리아크릴아 마드 젤 전기영동 패턴 분석에 의해 3개의 아종(F. nucleatum subsp. nucleatum, F. nucleatum subsp. polymorphum 및 F. nucleatum subsp. vincentii)으로 분류되었다[3]. 비슷한 시기에 F. nucleatum 은 glutamate dehydrogenase와 2-oxoglutarate reductase 단백 질의 전기영동 패턴과 DDH 분석에 의해 4가지 아종(F. nucleatum subsp. nucleatum, F. nucleatum subsp. polymorphum, F. nucleatum subsp. fusiforme 및 F. nucleatum subsp. animalis)으 로도 분류되었다[2,4,5]. F. nucleatum subsp. fusiforme과 F. nucleatum subsp. vincentii는 22개의 유전자들을 이용한 다좌위 서열 분석(multilocus sequence analysis)에 의해 F. nucleatum subsp. vincentii로 통합되어 재분류되었다[6].
16S ribosomal RNA 유전자(16S rDNA) 염기서열비교분석법과 DDH는 세균의 종-수준에서 동정하는 데 황금 기준(gold standard) 으로 이용되었다[7,8]. 즉, 이미 알려진 세균 종의 표준균주와 종-수준 으로 동정을 원하는 균주 간의 16S rDNA 핵산염기서열의 상동성이 97–98% 이상이고, DDH 값이 70% 이상인 경우에만 두 균주는 같은 종에 속하는 것으로 판정하였다[7,8]. 이들 중 DDH는 매우 까다롭고, 연구자 및 방법에 따라 편차가 크다는 단점이 있었다[9]. 최근 핵산염기 서열 결정법의 눈부신 발전과 세균 지놈 핵산염기서열 전체를 이용한 균주들 간의 상동성을 분석하는 프로그램이 개발되면서, DDH를 보완 하는 average nucleotide identity (ANI) 및 genome-to-genome distance (GGD) 분석법들이 DDH 분석법을 대체하게 되었다[9-13]. 최근 세균 지놈 핵산염기서열을 이용하여 신종 분류 연구에 이용할 경 우, 신종 후보 균주의 16S rDNA 핵산염기서열의 상동성이 표적 세균 종의 표준균주의 것과 98.7% 이상일 경우, ANI 또는 GGD 분석법을 이용해야 한다는 제안이 발표되었다[14]. 최근 F. nucleatum의 4가 지 아종들(F. nucleatum subsp. nucleatum, F. nucleatum subsp. polymorphum , F. nucleatum subsp. vincentii , F. nucleatum subsp. animalis)은 ANI 및 GGD 분석법에 의해 종-수준(F. nucleatum, F. polymorphum, F. vincentii, F. animalis)으로 재분류되었다 [15].
KCOM 1265 (= ChDC F288) 균주는 한국인 치은염 부위의 치면세 균막으로부터 분리되어 16S rDNA 핵산염기서열 비교분석법에 따라 F. nucleatum으로 동정되어 한국구강미생물자원은행에 기탁되었다. 하 지만, KCOM 1265 균주의 16S rDNA 핵산염기서열은 Fusobacterium hwasookii 표준균주(KCOM 1249T)와 F. polymorphum (이전 에 F. nucleatum subsp. polymorphum) 표준균주(ATCC 10953T) 의 것과 모두 99.6%의 상동성을 보여 종-수준으로 동정이 필요하였다. 그러므로, 본 연구는 KCOM 1265 균주의 지놈 핵산염기서열을 바탕으 로 종-수준으로 동정하기 위하여 시행되었다.
Materials and Methods
1. 세균 및 배양
본 연구에서 사용한 KCOM 1265 균주는 한국구강미생물자원은 행(Korean Collection for Oral Microbiology [KCOM], Gwangju, Korea)에서 분양받아 사용하였다. KCOM 1265 균주는 tryptic soy agar (TSA; BD Difco Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA)에 yeast extract (최종 농도, 0.5% ), hemin (0.5 mg/mL), cysteine HCl-H2O (0.05%) 및 vitamin K1 (2 mg/mL)를 첨가한 배지를 사용 하여 배양하였다. 이때 혼합 가스(10% H2, 5% CO2 및 85% N2)를 주 입한 혐기성 배양기(BACTRONEZ; Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 37℃ 조건에서 배양하여 본 실험에 사용하 였다.
2. 16S rDNA 염기서열을 이용한 계통분류학적 분석
KCOM 1265 균주의 지놈 DNA는 Cho 등[16]이 제시한 페놀:클로 로폼 추출법으로 추출하여 사용하였다.
KCOM 1265 균주의 16S rDNA는 universal primers인 27F (5’ -AGA GTT TGA TC[A/C] TGG CTC AG-3’) 및 1492R (5’-TAG GG[C/T] TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) [17]을 이용하여 pGEMT easy 벡터(Promega Corp., Madison, WI, USA)에 클로닝하고 [18], 솔젠트 사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. KCOM 1265 균주의 16S rDNA 핵산염기서열은 GenBank에 기탁하 였다(Table 1). KCOM 1265의 계통분류학적 분석에 함께 사용될 세 균 종의 표준균주와 그들의 16S rDNA 핵산염기서열의 GenBank accession number들은 Table 1에 정리하였다.
KCOM 1265 균주 및 이와 유전학적으로 가장 가까운 Fusobacterium 종들의 16S rDNA 핵산염기서열의 상동성은 MegAlign program (DNAStar LasergeneTM 8.0; DNAStar Inc., Madison, WI, USA) 을 이용하여 구하였으며, 이때 CLUSTAL W algorithm을 사용하였다 [16]. 또한, MEGA 6.06 프로그램을 이용하여[19], 계통수(phylogenetic tree)는 neighbor-joining method [20]을 이용하여 얻었다. 이 때 계통수의 안정성은 1,000 반복에 의한 bootstrap 분석법[21]으로 측정하였다.
3. 세균 지놈 핵산염기서열 결정
KCOM 1265 균주의 지놈 핵산염기서열은 PacBio RSII platform 과 Hiseq platform (에러 수정을 위함)을 이용하여 결정하였으며, 이 는 Macrogen 사(Seoul, Korea)에 의뢰하였다. 이때 DNA library는 20 kb SMRTbell templates와 Truseq DNA PCR free (350) 타입 을 이용하였다. 각각의 DNA library에서 얻어진 핵산염기서열들은 RS HGAP Assembly 3.0 [22] 프로그램의 기본 옵션(default option) 을 이용하여, 새로운 조합(de novo assembly) 방법으로 최종 KCOM 1265 균주 지놈 핵산염기서열을 결정하였으며, 이를 GenBank에 기탁하였다(GenBank accession number; PEQW00000000). KCOM 1265 균주의 지놈 핵산염기서열을 바탕으로 한 지놈 주석달기 (genome annotation)는 NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (NCBI Genome Submission Portal; https://submit. ncbi.nlm.nih.gov/subs/genome)을 이용하였다[23].
4. 세균 지놈 핵산염기서열 비교분석법에 의한 종-수준에서의 동정
KCOM 1265 균주 지놈 핵산염기서열을 이용한 종-수준에서 의 동정을 위해, ANI 분석법(http://www.ezbiocloud.net/tools/ani; ChunLab, Seoul, Korea) [24] 및 GGD 분석법(http://ggdc.dsmz; German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany) [25]을 이용하였다. 본 연구에서 사용 된 KCOM 1265 균주와 유전학적으로 가까운 Fusobacterium 종들 의 표준균주 지놈 핵산염기서열은 GenBank 데이터베이스(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=fusobacterium+period onticum)에 등록된 것을 사용하였으며, 이들의 GenBank accession number들은 Table 1에 정리하였다.
Results
KCOM 1265 균주와 10개 Fusobacterium 종 표준균주 간의 16S rDNA 핵산염기서열 상동성을 분석한 결과, KCOM 1265 균주 16S rDNA 핵산염기서열은 F. hwasookii KCOM 1249T와 F. polymorphum ATCC 10953T의 것과 가장 높은 상동성(99.6%)을 보였다(Fig. 1). 또한, Fusobacterium canifelinum RMA 1036T의 16S rDNA 핵 산염기서열과도 99.2%의 높은 상동성을 보였다(Fig. 1). KCOM 1265 균주 및 본 연구에서 이용한 10개 Fusobacterium 종 표준균주들의 16S rDNA 핵산염기서열을 바탕으로 계통분류학적 분석 결과, KCOM 1265 균주는 F. polymorphum ATCC 10953T와 같은 분지(cluster) 를 형성하였다(Fig. 2).
KCOM 1265 지놈 핵산염기서열을 결정한 결과, 2개의 contigs를 얻었다. 그중 하나는 2,541,594 bp로 구성되어 있으며, 환형 구조를 가져 염색체(chromosome)인 것으로 보였다(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/NZ_PEQW01000001.1). 여기에는 2,337개 단백질, 5개씩의 5S, 16S 및 23S rDNA가 암호화되어 있었다. 다른 하나는 13,120 bp로 구성된 환형 구조를 이루었고, 11개의 단백질이 암호화되어 있었다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_ PEQW01000002.1).
KCOM 1265 균주 지놈 핵산염기서열을 바탕으로 종-수준으로 동정 하기 위해 ANI와 GGD 분석을 한 결과, KCOM 1265 지놈과 F. polymorphum ATCC 10953T 지놈 간의 ANI 값이 95.8%였으며, GGD 값은 63.9% (61.0–66.7%)였다. 반면에 KCOM 1265 균주와 다른 Fusobacterium 종들의 표준균주들과의 ANI 또는 GGD 값들이 각각 93.0% 이하 및 49% (47.0–52.2%) 이하였다(Table 2).
Discussion
본 연구 결과, KCOM 1265 균주는 16S rDNA 염기서열비교법 및 지놈 핵산염기서열 상동성 분석법인 ANI와 GGD 분석법에 의해 F. polymorphum인 것으로 동정되었다.
세균의 종-수준에서의 동정에 있어서 16S rDNA 염기서열비교법 분 석에서 대상 세균 종의 표준균주의 것과 상동성도 중요하지만, 계통수 (phylogenetic tree)에서 같은 분지에 속하고, 분지간의 브스트랩 값 (bootstrap value)도 중요하다. 본 연구에서 KCOM 1265 균주의 16S rDNA 핵산염기서열은 F. polymorphum ATCC 10953T와 같은 분지 (cluster)를 형성하면서, 브스트랩 값이 64였다. 이러한 브스트랩 값 은 1,000번(브스트랩 값 구할 때 설정함) 반복하여 계통수를 만들 때, KCOM 1265 균주와 F. polymorphum ATCC 10953T 균주가 같은 분 지를 형성을 확률이 64%라는 의미이며, 이는 계통수가 얼마나 안정한 가를 의미한다. 통상 브스트랩 값이 60% 이상인 분지는 안정하다고 판 정된다. 하지만, 이러한 KCOM 1265의 16S rDNA 핵산염기서열이 F. hwasookii KCOM 1249T와 F. polymorphum ATCC 10953T 균주들 의 것과 모두 99.6%라는 높은 상동성을 보이기 때문에, 16S rDNA 핵 산염기서열 비교분석만으로는 KCOM 1265를 종-수준으로 동정할 수 는 없다고 판단되었다.
위와 같은 이유로, 균주 지놈 핵산염기서열 상동성 분석법인 ANI와 GGD 분석법을 이용하여 KCOM 1265 균주의 종-수준에서의 동정을 시도하였다. 어떤 균주와 특정 표적 세균 종 표준균주 간의 ANI 또는 GGD 값이 각각 95–96% 및 70% 이상이면, 그 균주는 표적 세균 종 으로 판정이 된다[24,25]. 본 연구 결과 KCOM 1265와 F. polymorphum ATCC 10953T 균주 간의 ANI 값은 같은 종으로 분류하는 기준 점에 합당하였지만, GGD 값은 이에 약 6.1% 미치지 못하였다. 이런 경우, 두 균주 간의 16S rDNA 핵산염기서열의 상동성이 98.7% 이상 이면 같은 종으로 판단된다[26]. 최근 16S rDNA 핵산염기서열 비교 분석법에 따라 Fusobacterium periodonticum으로 분류되었던 14 개 균주가 ANI 또는 GGD 분석을 통해 Fusobacterium pseudoperiodonticum으로 재분류 되었던 연구에서 그 예를 찾아볼 수 있다[26]. 그 연구에서 14개 균주의 16S rDNA 상동성은 99.3–100%였으며, ANI 값은 95.3–96.3%였지만, GGD 값은 61.6–72.5%였다[26].
세균 종-수준에서의 분류에 있어서 16S rDNA 핵산염기서열은 약 1.5 kpb 정도여서 지놈 핵산염기서열(약 2,000 kpb 이상)에 비해 핵 산염기서열 크기가 매우 작고, ANI 및 GGD 분석법도 핵산염기서열 의 상동성 분석이 기반인 점을 감안할 때, 16S rDNA 핵산염기서열 비 교분석법이 무시될 수 있다. 하지만, 16S rDNA 핵산염기서열 비교분 석법은 아직 세균 종 분류에 있어서 황금 기준의 하나로 사용되고 있 다. 그 이유 중 하나는 세균의 진화 과정에 있어서, 16S rDNA 핵산염 기서열이 같은 세균 종 간에 보존성이 매우 뛰어나기 때문이다. 그러므 로, 두 세균 균주 간의 ANI 또는 GGD 값이 각각의 종-수준으로 분류 하는 기준값보다 크다고 하더라도, 16S rDNA 핵산염기서열의 상동성 이 97% 이하라면, 같은 종이라 할 수 없다[27]. 이해 해당하는 세균 종 이 Streptococcus periodonticum이다[27]. 한국인의 구강에서 분리 된 ChDC F135 (= KCOM 2412) 균주는 Streptococcus anginosus 표준균주(NCTC 10713T)의 지놈 핵산염기서열과 ANI 값이 95.6%였 지만, 16S rDNA 핵산염기서열과의 상동성이 95.7%였기 때문에 신종 (Streptococcus periodonticum)으로 분류되었다. 즉, 세균의 종-수 준으로의 동정에 있어서, 두 균주 간의 16S rDNA 핵산염기서열 비교 분석법과 지놈 핵산염기서열을 이용한 ANI 또는 GGD 분석법 결과가 모두 일치하여만, 그들이 같은 세균 종이라고 판정할 수 있다.
이상의 결과를 요약하면, KCOM 1265 균주는 F. polymorphum ATCC 10953T의 16S rDNA 핵산염기서열과 99.6%의 상동성을, F. polymorphum ATCC 10953T의 지놈 핵산염기서열과 95.8%의 ANI 값을 보였기에 F. polymorphum인 것으로 판단된다.