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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)
International Journal of Oral Biology Vol.50 No.2 pp.41-52
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2025.50.2.41

Genome-based identification of three Capnocytophaga ochracea strains isolated from Korean oral cavities

Yun Kyong Lim1,2, Soon-Nang Park1,2, Joong-Ki Kook1,2*
1Department of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Chosun University, Gwangju 61452, Republic of Korea
2Oral Bacterial Pathogen Resource Specialized Bank and Korean Collection for Oral Microbiology, Chosun University, Gwangju 61452,
Republic of Korea

This work is partially derived from the doctoral dissertation of Yun Kyong Lim, submitted to the Graduate School of Chosun University in 2023.


*Correspondence to:: Joong-Ki Kook, E-mail: jkkook@chosun.ac.krhttps://orcid.org/0000-0003-2628-2870
March 15, 2025 April 14, 2025 April 17, 2025

Abstract


Three strains (KCOM 2191, KCOM 2668, and KCOM 2812) of Capnocytophaga sp. isolated from a Korean population were initially classified by 16S rDNA sequence comparison. This study aimed to resolve their species-level identity using whole genome sequencing and to assess their taxonomic characteristics. Genomes of the three strains were sequenced using PacBio RS II and Illumina platforms. Average nucleotide identity (ANI) analysis was employed for species-level identification. Cellular fatty acid (CFA) compositions were determined using the MIDI/Hewlett Packard Microbial Identification System. ANI values for KCOM 2191, KCOM 2668, and KCOM 2812 were 96.43%, 96.33%, and 96.33%, respectively, compared with the type strain Capnocytophaga ochracea DSM 7271T. CFA profiling showed a predominance of iso-C15:0 (57.9%, 67.2%, and 64.9%, respectively), consistent with DSM 7271T (51.5%). These findings confirm that KCOM 2191, KCOM 2668, and KCOM 2812 are strains of C. ochracea . These strains may serve as valuable models for investigating the role of C. ochracea in oral and systemic pathogenesis.


Average nucleotide identity , Capnocytophaga ochracea , Genome , Identification

초록

    © The Korean Academy of Oral Biology. All rights reserved.

    This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

    Introduction

    Capnocytophaga spp.는 방추형에서 막대 모양의 그람 음성 세균 이며, 고형 배지의 단단한 표면을 미끄러지듯 이동할 수 있는 운동성 (gliding) 집락을 형성하는 특성을 가지고 있다[1]. 또한 무산소 또는 호 기성 조건에서 CO2 (5–10% v/v)의 존재에 의존하여 성장하는 특성 을 가지고 있다. ‘Capnocytophaga’라는 속명은 CO2 의존성이 있음 을 의미하는 “capno-”와 유연성 및 글라이딩 운동성을 갖는 세균 속 명 “Cytophaga”에서 유래한다[1]. Capnocytophaga spp.는 현재 사 람 구강에서 분리된 9종(Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga haemolytica, Capnocytophaga granulosa, Capnocytophaga leadbetteri, Capnocytophaga endodontalis, Capnocytophaga periodontitidis, Capnocytophaga blienii), 개와 고양이의 구강에 서 발견될 수 있는 인수공통 병원체 4종(Capnocytophaga canimorsus, Capnocytophaga canis, Capnocytophaga cynodegmi, Capnocytophaga stomatis ) 및 고양이의 구강에서 분리된 1종 (Capnocytophaga felis)이 보고되었다(List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature, https://lpsn.dsmz.de/) [1-9]. Capnocytophaga spp.는 면역이 저하된 숙주와 면역이 저하되지 않 은 숙주 모두에서 질병을 유발할 수 있는 것으로 보고되었다[10,11]. Capnocytophaga spp.는 면역력이 저하된 숙주에서 균혈증[12], 뇌농 양[13,14], 뇌수막염[15,16], 심내막염[17], 뼈 감염[18], 융모막양막 염[19]을 포함한 다양한 구강 외 감염의 원인이 되는 기회감염성 세균 이다. Capnocytophaga spp.는 또한 폐암 환자의 타액 미생물군을 정 량적 중합효소연쇄반응법을 사용하여 조사한 결과 대조군과 비교하여 유의하게 더 높은 것으로 보고되었다[20].

    현재, 세균을 종-수준으로 동정하기 위한 황금 기준(gold standard) 이 되는 분류학적 실험법은 16S ribosomal RNA gene (16S rDNA) 의 염기서열 비교분석법[21,22]과 세균 전장 유전체 염기서열(whole genome sequence, WGS)의 상동성을 in silico 프로그램으로 비교 분석하는 average nucleotide identity (ANI) 분석법[23-25] 또는 genome-to-genome distance calculator (GGDC) 분석법[26,27] 이다. 특히 ANI 혹은 GGDC 분석법은 차세대 핵산 염기서열 결정법 (next generation sequencing, NGS)의 발전에 의해, 기존의 물리 적 방법에 의한 세균 전장 유전체 비교법인 DNA-DNA hybridization (DDH) 법을 대신할 수 있게 되었다. 세균 균주를 종-수준으로 정 확히 동정하기 위해서는 16S rDNA 염기서열 비교분석법과 ANI 혹은 GGDC 분석법을 통한 WGS 상동성 분석법을 시행하여야 한다.

    본 연구에서는 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, KCOM)에서 16S rDNA 염기서열 비교분석법만으로 Capnocytophaga sp.로 동정된 3개 균주를 분양받아, 이들의 WGS를 결정하고, ANI 및 GGDC 분석법을 실행하여 종-수준으로 최종 결정하 고자 한다. 이와 더불어 본 연구는 이들 균주들의 형태학적 특성, 생화 학적 특성, 지방산 조성 분석, 극성 지방 분석, 퀴논분석 및 최적 성장조 건 측정을 통하여, 이들의 특성을 밝히기 위해 시행되었다. 향후 치주질 환과의 관련성을 연구하는 병인론 연구 방법 중 하나인 숙주-세균 상호 작용 연구에 이들 3개 균주를 이용할 수 있을 것이며, 균주 특성 정보는 결과를 해석하는 데 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

    Materials and Methods

    1. Bacteria and bacterial culture

    본 연구에 사용된 C. ochracea KCOM 2191, KCOM 2668, KCOM 2812 균주들은 KCOM에서 분양받아 사용하였다. 이들 균주들은 tryptic soy broth (BD Difco Laboratories)에 0.5% yeast extract, 5 μg/mL hemin, 0.05% cysteine HCl-H2O, 및 2 μg/mL vitamin K1이 포함된 배지를 사용하여 실험에 사용하였다. 다만, 이들의 최적 성장에 필요한 NaCl 농도를 결정하기 위한 실험에서만, trypticase peptone (BD Difco Laboratories)에 0.5% yeast extract, 0.25% K2HPO4, 0.25% glucose, 5 μg/mL hemin, 0.05% cysteine HCl- H2O 및 2 μg/mL vitamin K1이 포함된 배지를 사용하였다. 이들 균주 들은 무산소 조건(5% H2, 10% CO2, 85% N2)과 37℃가 유지되는 무 산소 배양기(BACTRONEZ-2; Sheldon Manufacturing Inc.)에서 24–48시간 동안 배양하였다.

    2. Phylogenetic analysis based on 16S rDNA nucleotide sequences

    본 연구에서 사용된 모든 균주들의 16S rDNA 염기서열은 GenBank 데이터베이스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)에서 얻었 으며, Table 1에 정리하였다. 이들의 상동성은 EzBioCloud 프로그램 (CJ Bioscience, https://www.ezbiocloud.net/)을 사용하여 검색 하였다. 그 결과 각각의 균주들과 상동성이 91% 이상인 균종들의 표준 균주들의 염기서열과 함께, MEGA X [28] 프로그램을 이용한 계통분류 학적 분석을 실시하였다. MEGA X의 Clustal W 법으로 분석하고자 하 는 16S rDNA 염기서열을 정렬(alignment)하고, neighbor-joining methods [29]를 이용하여 계통수(phylogenetic tree)를 얻었다. 이 때 계통도의 신뢰도를 높이기 위해, bootstrap 값은 1,000회로 정하였 으며, 비교 대상이 되는 균주들의 진화적 거리(% distance로 표현함)는 Kimura 2-parameter model을 이용하여 구하였다.

    3. Bacterial WGS determination and species-level identification

    본 연구에 사용된 균주들의 WGS를 결정하기 위해 Cho 등[30]이 제 시한 페놀–클로로포름 추출법을 시행하여 전장 유전체 DNA를 추출한 후, Macrogen 사에 의뢰하였다. PacBio RS II 및 Illumina platform 을 이용하여 시퀀싱하고, RS HGAP 및 SPAdes 소프트웨어를 사용 하여 assembly 되었으며, genome annotation은 Prokka (https:// github.com/tseemann/prokka)를 이용하여 수행되었다.

    WGS를 이용한 종-수준에서의 동정을 위한 ANI 분석은 ChunLab에 서 제공하는 소프트웨어(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)를 사용하여 시행하였으며, GGDC 분석은 DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에서 제공하는 소프트웨어 프로그램(https://ggdc.dsmz.de/)을 사용하여 수행하였다. ANI 및 GGDC 분석을 위한 균주의 전체 게놈 서열 및 GenBank accession number는 Table 1에 정리하였다.

    4. Morphological characterization

    균주들의 집락 모양과 크기를 측정하기 위하여 한천배지에서 2일 동 안 배양하여 실체현미경(ZEISS Stemi 305; ZEISS Microscopy) 검 경을 시행하였다.

    그람염색은 먼저 균주의 집락과 생리식염수를 섞어 슬라이드글라스 위에 도말하고 건조 후 화염 고정하여 준비하였다. crystal violet으로 1 분, Lugol 용액으로 1분, alcohol 탈색 20초, safranine으로 30초간의 순서로 염색하였다(YD Diagnostics CORP.). 물로 세척하고 건조 후 검경하였다.

    균주들의 자세한 모양 관찰과 크기를 측정하기 위하여 주사전자현 미경(scanning electron microscope, SEM) 검경을 시행하였다. 하 루 동안 배양된 균액을 2.5% paraformaldehyde-glutaraldehyde (Sigma-Aldrich) 용액으로 실온에서 3시간 동안 전고정 처리 후, 1% osmium tetraoxide (Sigma-Aldrich) 용액으로 실온에서 40분 동안 후고정 처리하였다. 그 다음 50%, 70%, 80%, 90%, 100% ethanol 을 단계적으로 처리하여 시료를 탈수한 후 hexamethyldisilazane (Sigma-Aldrich)으로 화학적 건조를 하였다. 이렇게 전처리한 시료는 stub 위에 부착시켜 sputter coater 안에 platinium으로 코팅하고 5 kV에서 electron microscope (S-4800; Hitachi)로 검경하였다.

    5. Biochemical characterization

    무산소 세균을 동정하기 위한 API 20 A 및 RAPID ID 32 A (bio- Mérieux)를 사용하여, 제조사의 지침에 따라 균주의 생화학적 특성, 효 소 활성 및 당 발효 패턴을 분석하였다.

    6. Bacterial fatty acid composition analysis

    균주들은 48시간 배양한 후 균체를 모아 비누화 및 메틸화시킨 후 fatty acid methyl ester를 추출하였다. 세균 지방산 조성은 제조업체 의 지침에 따라 가스크로마토그래피(6890N GC with 7683 Autosampler; Agilent)를 사용하여 분석되었고, MIDI/Hewlett Packard Microbial Identification System (MIS)을 이용한 Sherlock™ MIS (version 6.3; MIDI, Inc.)를 사용하여 동정되었다. 이러한 세균 지방산 조성 분석은 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms) 에 의뢰하여 실시하였다.

    7. Polar lipid analysis

    Minnikin 등[31]이 제시한 방법대로 균주들은 48시간 동안 배양하 여 균체를 모아 동결건조한 후 메탄올:0.3% NaCl (100:10) 용액과 헥 산을 동량 첨가하고 혼합하였다. 잘 섞어진 혼합액을 원심분리 후 상층 을 제거하고 다시 헥산을 첨가하여 잘 섞어준 후 원심분리하여 상층액 을 제거하였다. 남아있는 하층을 100℃에서 5분간 가열하고 37℃에 서 5분 정도 식힌 후 클로로폼:메탄올:0.3% NaCl (90:100:30)를 첨 가하고 1시간 동안 교반하여 잘 섞어준 후 원심분리하여 상층액을 다 른 tube에 옮겨 담았다. 남아있는 하층에 클로로폼:메탄올:0.3% NaCl (50:100:40) 용액을 첨가하고 30분 동안 교반하여 잘 섞어준 후 원 심분리하여 상층액을 이전 상층액과 합하였다. 상층액에 클로로폼과 0.3% NaCl 용액을 동량 첨가한 후 원심분리하여 상층을 제거한 하층 부분을 rotary evaporator에서 건조하였다. 최종적으로 증류수에 용해 한 시료를 박층 크로마토그래피(thin-layer chromatography, TLC)로 전개하여 분석하였다.

    High-performance TLC silica gel plate (10 × 10 cm; Merck) 에 시료를 spotting한 후 건조하였다. 클로로폼:메탄올:물(65:25:3.8) 용매 하에서 1차 전개한 후, plate를 건조시키고 클로로폼:메탄올:아세 트산:물(40:7.5:6:1.8) 용매 하에서 2차 전개를 하였다. 이때 standard plate와 시료 plate를 동시에 같은 조건으로 전개하였다. 전개가 끝난 plates는 hood 안에서 잘 건조시킨 후 5% ethanolic molybdatophosphoric acid (모든 지질 검출) 발색 시약을 분사기(spray)로 골고 루 뿌려주고 100℃의 오븐에 건조시키고 스캔하여 결과를 확인하였다. 또한 0.2% ninhydrin (아미노 지질 검출), zinzadze (인지질 검출) 및 α-naphthol (2.4% [w/v] α-naphthol in 10% [v/v] sulfuric acid, 80% [v/v] ethanol) (당지질 검출)의 발색 시약을 사용하여 분사기로 골고루 뿌려주고 100℃의 오븐에 건조시킨 후 스캔하여 결과를 확인하 였다. 이러한 세균의 극성 지방 분석은 한국미생물보존센터에 의뢰하여 실시하였다.

    8. Quinone analysis

    세포막에 존재하는 아이소프레노이드 퀴논을 추출하기 위해 Shin 등 [32]이 제시한 방법을 이용하였다. 균주들을 48시간 동안 배양하여 균 체를 모아 동결건조한 후, 클로로폼:메탄올(2:1) 용액을 넣은 혼합액을 종이 여과지(110 mm, No. 2; Whatman)에 여과하였다. 여과된 용 액은 농축한 후 클로로폼:메탄올(8.5:1.5) 용액으로 녹이고 원심분리한 상등액을 시료로 고성능 액체 크로마토그래피(YL9100 HPLC; Young Lin Co.) 분석을 하였다. HPLC 분석 컬럼은 Waters Spherisorb ODS2 컬럼, 5 µm, 4.6 × 150 mm column을 사용하였으며, 분석 용매는 메탄올:아이소프릴에테르(4:1) 용액을 사용하여 1.0 mL/min 유속으로 254 nm 파장에서 검출하였다. 이러한 퀴논 분석은 한국미생 물보존센터에 의뢰하여 실시하였다.

    9. Determination of optimal growth conditions

    최적 성장 온도를 조사하기 위해 25–45℃ (5℃ 간격) 조건에서 1일, 2일 및 3일 동안 액체 배양하여 Epoch Microplate Spectrophotometer (BioTek)를 사용하여 UV 600 nm 파장의 optical density (OD) 값을 측정하였다. 이때 blank로 세균을 넣지 않은 액체배지(pH 7.0, 0.5% NaCl)를 같은 조건으로 배양하였다.

    최적 성장 수소이온농도를 조사하기 위해 pH 5–10 (pH 0.5 간격) 조 건에서 1일, 2일 및 3일 동안 37℃에서 액체 배양하여 OD 값을 측정하 였고, 이때 blank로 세균을 넣지 않은 액체배지(0.5% NaCl)를 같은 조 건으로 배양하였다.

    최적 성장 NaCl 농도를 조사하기 위해 0–2% (0.5% 간격) 농도에서 1일, 2일 및 3일 동안 37℃에서 액체 배양하여 OD 값을 측정하였다. 이때 blank로 세균을 넣지 않은 액체배지(pH 7.0)를 같은 조건으로 배 양하였다.

    각 실험군의 OD 값에서 blank의 OD 값을 뺀 수치를 각 실험군의 실 질적인 성장 정도를 나타내는 값으로 삼았으며, 최적 성장 조건은 이 수 치가 가장 높은 값의 것으로 결정하였다.

    Results

    1. 16S rDNA sequence homology and phylogenetic analysis

    EzBioCloud 프로그램을 사용하여 각 균주들의 16S rDNA 염기서 열들의 상동성을 검색한 결과는 Table 2에 정리하였다. KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주는 C. ochracea DSM 7271T 표준 균주의 16S rDNA 염기서열과 가장 높은 상동성을 보였다. 이 균주들 의 16S rDNA 염기서열의 진화론적 측면에서 가장 가까운 종을 알아보 기 위한 계통수 분석 결과, KCOM 2812와 KCOM 2191은 cluster (클 러스터) CC-1-1에, KCOM 2668은 C. ochracea DSM 7271T와 함 께 클러스터 CC-1-2에 속하였다(Fig. 1). 이들 4개 균주들은 클러스터 CC-1에 배열되었다(Fig. 1).

    2. Three strains identified as C. ochracea through ANI and GGDC analysis

    본 연구에서 사용된 균주들의 WGS를 분석한 결과, KCOM 2191, KCOM 2668, KCOM 2812 균주들의 전장 유전체 크기는 2.67–2.80 Mb였으며, G+C 함량은 39.3–39.7 mol%였다(Table 3). 본 연구에서 사용된 3개 균주들의 WGS는 GenBank submission portal (https:// submit.ncbi.nlm.nih.gov/)에 업로드하였으며(Table 1), 분석 결과 는 Table 3에 요약하였다. WGS를 이용한 종-수준에서의 동정을 위 한 ANI 분석 결과, KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균 주는 C. ochracea DSM 7271T 표준균주와 약 96.3% 이상의 상동성 을 보였다(Table 4). 그리고 GGDC 분석 결과, KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주는 C. ochracea DSM 7271T 표준균주와 66.0–67.9%의 상동성을 보였다(Table 5).

    3. Morphological characterization by SEM and stereomicroscopy

    SEM으로 검경하여 측정한 균체 길이는 Table 6에 정리하였다. KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들의 모양은 1–13 µm 되는 다양한 길이의 편모가 없는 방추형이었다(Fig. 2).

    한천배지에서 2일 동안 배양하여 실체현미경으로 관찰한 균주들의 집 락 모양과 크기는 Table 6에 정리하였다. KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들의 한천 배지에서 집락의 형태는 단단한 표면을 미끄러지듯 이동할 수 있는 gliding 운동성 집락을 형성하였다(Fig. 2).

    4. Biochemical characteristics

    무산소 세균을 동정하기 위한 API 20 A kit와 RAPID ID 32 A kit를 사용하여 균주의 생화학적 특성, 효소 활성 및 당 발효 패턴을 분석한 결과를 Supplementary Table 1과 Supplementary Table 2에 정리 하였다.

    KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들 모두 alkaline phosphatase, alanine arylamidase, arginine arylamidase, glutamyl glutamic acid arylamidase, glycine arylamidase, histidine arylamidase, leucine arylamidase, leucyl glycine arylamidase, phenylalanine arylamidase, proline arylamidase, serine arylamidase, tyrosine arylamidase의 효소들이 존재하였고, esculin 을 가수분해할 수 있었다. D-glucose, D-lactose, D-sucrose, Dmaltose, D-cellobiose, D-mannose, D-raffinose를 기질로 하여 산을 생성할 수 있었다(Table 7).

    5. Analysis of bacterial fatty acid composition, polar lipids, and quinones

    세포막을 구성하는 지방산의 구성 성분 및 비율 등을 참고로 미생물 을 동정하기 위한 세균 지방산 조성 분석 결과, KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들은 iso-C15:0 성분이 각각 57.9%, 67.2%, 64.9%의 비율로 가장 많이 검출되었다(Table 8).

    극성 지방 구조를 분석한 결과 KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들은 phosphatidylethanolamine, 3개의 알 수 없 는 aminolipids, 5개의 알 수 없는 lipids가 존재하였다. KCOM 2191 균주에서 한 개의 알 수 없는 phospholipid (PL)가 추가로 존재하였다 (Supplementary Fig. 1).

    퀴논 분석 결과, KCOM 2191 균주에서 menaquinone (MK)-6와 한 개의 비동정 MK가 존재하였다. KCOM 2668과 KCOM 2812 균주 에서 MK-6가 분석되었다. 그리고 다른 Capnocytophaga spp.의 표 준균주들에서도 MK-6가 존재하고 있음을 확인하였다.

    6. Optimal growth conditions

    최적 성장 조건을 조사하기 위해 다양한 조건의 온도, pH, NaCl 농도 에서 3일 동안 2회 반복하여 배양하고 OD 값을 측정한 결과, KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812의 세 균주들은 30–40℃의 범위 내의 온도에서 성장하였으며 각각 40℃, 35℃ 및 40℃에서 최적의 성 장을 보였다. 세 균주 모두 pH 6.0–9.0 범위 내에서 성장하였으며 pH 7.5–8.0에서 최적의 성장을 보였다. KCOM 2191과 KCOM 2668 균 주들은 NaCl 0–2% 범위 내의 농도에서, KCOM 2812 균주는 NaCl 0–1.5% 범위 내의 농도에서 성장하였으며 세 균주들 모두 NaCl 0% 농도에서 최적의 성장을 보였다.

    Discussion

    본 연구는 16S rDNA 염기서열 비교분석법으로 Capnocytophaga sp.로 동정된 3개 균주의 WGS를 결정하여 종-수준으로 최종 동정하 고 이들의 형태학적 특성, 생화학적 특성, 지방산 조성 분석, 극성 지방 분석, 퀴논 분석 및 최적 성장 조건 측정을 통하여 특성을 밝혀, 향후 병 인론 연구에 이용하고자 시행되었다.

    본 연구 결과 KCOM 2191, KCOM 2668, KCOM 2812 균주들 의 세균 WGS의 ANI 분석법에서 C. ochracea 표준균주와 ANI 값이 96.33–96.43%의 상동성을 보였다(Table 4). 반면에, GGDC 분석에 의한 결과에 의하면, 이들 세 균주는 C. ochracea 표준균주와 GGDC 값이 66.0–67.9%로 같은 종의 기준이 되는 70% 이하의 상동성을 보 였다(Table 5). 또한, 이들 세 균주들의 16S rDNA 염기서열 상동성 은 C. ochracea 표준균주와 97.14–98.12%를 보여, Stackebrandt 와 Ebers [33]에 의해 제시된 98.7% 이하의 상동성을 보였다. 하지 만, Stackebrandt와 Goebel [21]이 제시한 97.0%보다는 높은 상동 성을 보였다. 세균의 종-수준의 동정에 있어서, 종-수준으로 분류를 요 하는 균주와 기존에 알려진 특정 종의 표준균주의 16S rDNA 상동성이 98.7% 이상일 경우, 표적 균주를 해당 표준균주와 같은 종으로 동정하 고, 16S rDNA 상동성이 98.7% 이하일 경우, WGS를 반드시 밝혀서 ANI 혹은 GGDC 분석법을 시행하여 최종 종-수준으로 동정하는 것이 제안되었다[27]. Kim 등[22]에 의해, ANI 분석법 중 하나인 OrthoANI 분석 알고리즘을 개발하는 과정에서, 기존에 GenBank 데이터베이스 에 16S rDNA와 WGS가 모두 저장되어 있는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans 균주 간의 ANI 값은 97.43–99.09%로 높은 편이었지만, 16S rDNA 상동성 값은 98.00–98.20%로 낮았다는 것이 보고되었다. 그리고, 최근 Fusobacterium nucleatum의 4개 아종을 새로운 4개 종으로 재분류한 연구에서도, Fusobacterium animalis 종 에 속하는 균주들과 F. animalis ATCC 51191T 표준균주의 ANI 값은 96% 이상이었지만, GGDC 값이 70% 미만인 것도 있었다[34]. 이러 한 연구결과들을 종합할 때, 비록 KCOM 2191, KCOM 2668, KCOM 2812 균주들의 GGDC 값이 C. ochracea 표준균주와 같은 종의 기 준이 되는 70%보다는 약간 낮은 값(66.0–67.9%)을 보였지만, 16S rDNA 상동성 값이 97% 이상이었고, ANI 값이 95% 이상이었다는 점 을 고려하면, 이들 균주들은 C. ochracea로 분류된다고 판단된다. 하지 만, 본 연구에서 3개 균주들의 종-수준으로의 동정에 있어서, WGS 상 동성 비교분석법인 ANI 분석과 GGDC 분석에 의한 결과가 상이한 경 우가 있다는 것은, 아직도 세균의 종-수준에서의 분류법에 있어서 문제 점이 있다는 것을 시사한다. 특히, 종-수준으로의 기준이 되는 ANI 혹 은 GGDC 값은 기존의 16S rDNA 염기서열 상동성 비교분석법과 물리 적인 방법으로 측정한 전장 유전체 상동성 법인 DDH 법의 결과를 기준 으로 설정된 것이 그 원인들 중 하나라고 판단된다. 그러므로, 향후 종-수 준에서의 동정에 있어서 새로운 기준법 확립이 필요할 것으로 생각된다.

    본 연구 결과 WGS 상동성 비교분석법으로 C. ochracea로 동정된 KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들의 G+C 함량은 C. orachea 표준균주의 G+C 함량과 1 mol% 미만의 차이가 있는 것 으로 조사되었다(Table 7). NGS가 개발되기 전, 열변성(thermal denaturation), CsCl을 이용한 부력 밀도, 용해 프로파일(melting profile) 및 고성능 액체 크로마토그래피 등을 이용하여 간접적으로 세균 전 장 유전체의 G+C 함량을 측정할 때, 같은 세균 종에 속하는 균주들간 의 G+C 함량은 3 mol% 또는 5 mol%인 것으로 보고되었다[35,36]. 하지만, 세균 WGS를 직접 결정하여 G+C 함량을 분석한 결과 같은 종 에 속하는 균주들간의 G+C 함량의 차이는 1 mol% 미만인 것으로 조 사되었다[36]. 이상의 본 연구 대상인 3개 균주들의 전장 유전자 염기 의 G+C 함량을 조사한 결과에 의하면, KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들은 C. ochracea에 속하는 것으로 판단된다.

    본 연구에서 세균 지방산 조성 분석 결과 KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들의 주요한 지방산은 iso-C15:0 성분 (58–67%)인 것으로 조사되었다(Table 8). 이는 Capnocytophaga spp.의 표준균주들에서도 iso-C15:0 성분이 52–73%로 가장 높은 비율을 차지하는 것으로 보고되어, 이들 균주들이 Capnocytophaga spp. 특성을 갖는 것으로 조사되었다(Table 8). 이들 세균 균주들의 C16:0 3OH 성분이 3.0–4.8%와 C18:0 성분이 1.9–2.3%였으며, 이 는 C. ochracea 표준균주보다 각각 약 2–3배와 6배 정도 적은 비율로 존재함을 알 수 있었다.

    본 연구에서 생화학적 특성을 비교 분석한 결과, KCOM 2191, KCOM 2668, KCOM 2812 균주들은 D-glucose, D-lactose, Dsucrose, D-maltose, D-cellobiose, D-mannose, D-raffinose 를 기질로 산을 생성할 수 있었고, 이는 C. ochracea 및 C. endodontalis 표준균주와 동일한 결과였다(Table 7). 또한 이들 균주들은 모두 esculin 가수분해를 하였다(Table 7). 이들과 다르게 C. sputigena ATCC 33612T 및 C. haemolytica ATCC 51501T 표준균주는 D-glucose를 기질로 산을 생성하지 않았으며, 질산염 환원 시험에서 양성반 응을 보여 차이가 있었다(Table 7) [37]. C. gingivalis ATCC 33624T 및 C. granulosa ATCC 51502T 표준균주 또한 D-glucose를 기질로 산을 생성하지 않았으며, esculin 가수분해를 하지 않는 차이점을 보였 다(Table 7). 본 연구에서 KCOM 2191, KCOM 2668, KCOM 2812 균주들에게 존재하는 극성 지방 종류는 KCOM 2191 균주에서 한 종류 의 PL을 제외하고 동일하였다(Supplementary Fig. 1). KCOM 2191, KCOM 2668, KCOM 2812 균주들에 존재하는 전자운반체인 퀴논 의 종류를 알아본 결과, 세 균주 모두 MK-6를 가지고 있었다. 이는 Capnocytophaga spp.들이 MK-6를 가지고 있음과도 일치하였다. 다 만, KCOM 2191은 MK-6 이외의 또 다른 퀴논을 가지고 있는 것으로 확인되었으며, 이는 다음 연구에서 어떤 종류인지 밝히고자 한다. 이상 의 본 연구에서 사용된 균주들의 생화학적 및 화학분류학적 실험 결과, KCOM 2191, KCOM 2668, KCOM 2812 균주들은 C. ochracea 표 준균주와 유사한 특성을 보였다.

    Leadbetter 등[1]은 C. ochracea 표준균주의 모양을 짧거나 길쭉 한 막대모양이며 폭과 길이가 0.38–0.45 × 2.5–4.2 µm로 끝이 둥 글거나 가늘다고 설명하였다. 또한 혈액 한천배지에서 집락은 얇고 평 평하며 가장자리가 고르지 않으며 접종 지점을 넘어 퍼지며 자라는 활 주(gliding) 운동성을 보이는 특징을 설명하였다[1]. 활주 운동성이 있 는 Cytophaga spp. 및 Flexibacter spp.와 Capnocytophaga spp. 간의 차이점은, Capnocytophaga spp.의 성장에는 CO2가 필요하 고, catalase와 oxidase에 대해 음성 반응을 보인다는 것이다. KCOM 2191, KCOM 2668, KCOM 2812 균주들의 형태를 관찰한 결과, Leadbetter 등[1]이 설명한 C. ochracea 표준균주의 특징들과 일치하 였으며, 5% CO2의 호기성 또는 무산소 환경에서 성장하였으며, 그람염 색 결과 음성, catalase 음성을 보였다(Fig. 2, Supplementary Table 1). 이들 균체의 폭과 길이는 0.23–0.31 × 1.2–12.9 µm, 집락의 크 기는 0.2–0.6 mm로 측정되었다(Table 6).

    KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들의 최적 성장조 건은 각각 40℃, 35℃ 및 40℃에서, pH 7.5–8.0에서, NaCl 0% 농도 에서 최적의 성장을 보였다. KCOM 2191 균주는 NaCl 2% 농도에서 느린 성장을 보였지만, 배양 3일까지 계속 증식하는 결과를 보여 향후 NaCl 2% 이상의 농도에서 추가 조사가 필요해 보인다.

    C. ochracea는 치주질환 병소보다는 건강한 상태 또는 치은염이나 경미한 치주염 병소의 치면세균막에서 검출 빈도가 높은 것으로 조사되 었다[38-40]. 또한, 급속진행형치주염 환자를 대상으로 한 연구 결과 에 의하면, C. ochracea는 Prevotella intermedia와 A. actinomycetemcomitans와 더불어 화농성이 있는 병소에서 그렇지 않은 병소 에서 보다 유의성 있게 검출되었다[41]. 반면에, C. ochracea는 구강 이외의 조직 또는 장기에서 복막염[42,43], 세균혈증 혹은 패혈증[44-47], 심내막염[48], 골수염[49], 고름신장증[50], 자궁경부농양[51], 뇌 농양[14] 및 패혈관절염[52] 등의 구강 외 조직 병소에서 검출되었다. 이러한 연구 결과는 C. ochracea는 심한 치주염보다는 구강 외 조직 의 세균 감염성질환 발병에 더 관여하는 것으로 생각된다. 이처럼, C. ochracea 종들은 구강 및 전신 장기에서 감염성 질환과 관련성이 있는 것으로 보고되었다. 하지만, 현재 이들 세균 종의 병인론 연구는 미미하 고 특히 유전학적, 형태학적, 생화학적 및 화학분류학적 특성이 밝혀진 한국인 유래 균주들의 연구도 거의 없는 실정이다. 그러므로, 본 연구에 서 여러 특성을 밝힌 3개 균주들은 여러 병인론 연구에서 유용하게 이 용될 수 있을 것으로 판단된다.

    이상의 연구 결과를 요약하면, 16S rDNA 염기서열 상동성 비교분석 법으로 C. ochracea로 임시 동정된 3개 균주들의 WGS를 결정하고, 이들의 상동성 비교분석법인 ANI와 GGDC 분석 그리고 G+C 함량 비 교 분석에 의해 KCOM 2191, KCOM 2668 및 KCOM 2812 균주들 은 C. ochracea에 속하는 것으로 판단된다. 본 연구 결과에서 얻은 균 주들의 형태학적 특성, 생화학적 특성, 지방산 조성, 극성 지방조성, 퀴 논 조성 및 최적 성장조건 등의 특성 정보는, 이들 균주들의 보존 및 분 류학적 연구에 참고 자료로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 이들 균주들 은 향후 숙주-세균 상호작용 등과 같은 병인론 연구에 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

    Funding

    이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지 원을 받아 수행된 연구임(No. 2021R1A2C2009051).

    Conflicts of Interest

    No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

    Supplementary Data

    Supplementary data is available at http://www.kijob.or.kr only.

    Figure

    IJOB-50-2-41_F1.gif

    Phylogenetic trees based on partial nucleotide sequences of 16S ribosomal RNA genes of type strains of genus Capnocytophaga. The resulting tree topology was evaluated by bootstrap analyses (1,000 replicates, represent the value as % in the front of each cluster) with the neighbor-joining method of MEGA X software [28].

    IJOB-50-2-41_F2.gif

    Morphological characterization of Capnocytophaga ochracea strains: (A) KCOM 2191, (B) KCOM 2668, and (C) KCOM 2812. Each row displays colony morphology (left, scale bar = 500 μm), Gram staining microscopy (middle, scale bar = 20 μm), and scanning electron microscopy (SEM) images (right, scale bar = 5 μm).

    Table

    GenBank accession numbers of nucleotide sequences of 16S ribosomal RNA genes and genomes of bacterial strains used in this study

    16S rDNA, 16S ribosomal RNA gene.

    Summary of sequence analysis of 16S ribosomal RNA genes of three strains of Capnocytophaga ochracea isolated from a Korean population

    Summary of whole genome sequences of three strains used in this study

    aThe total number of reads that passed filtering. bThe number of unique reads that include a given nucleotide in the reconstructed sequence. c50% of all bases come from subreads longer than this value.

    Summary of average nucleotide identity analysis for three strains of Capnocytophaga ochracea isolated from a Korean population

    ANI, average nucleotide identity.

    Summary of genome-to-genome distance calculator analysis for three strains of Capnocytophaga ochracea isolated from a Korean population

    GGDC, genome-to-genome distance calculator; DDH, DNA-DNA hybridization; CI, confidence interval.

    Summary of cell morphology observation

    Summary of biochemical characteristics of three strains of Capnocytophaga ochracea used in this study and type strains of Capnocytophaga spp.

    aStrains: 1, KCOM 2191; 2, KCOM 2668; 3, KCOM 2812; 4, C. ochracea ATCC 27872T; 5, Capnocytophaga endodontalis ChDC OS43T; 6, Capnocytophaga sputigena ATCC 33612T; 7, Capnocytophaga haemolytica ATCC 51501T; 8, Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624T; 9, Capnocytophaga granulosa ATCC 51502T.

    Chemotaxonomic characteristics of three strains of Capnocytophaga ochracea used in this study and type strains of Capnocytophaga spp.

    CFA, cellular fatty acid; tr, trace (less than 1%).
    aIf the fatty acid content was less than 1% in all strains, it was omitted. bStrains: 1, KCOM 2191; 2, KCOM 2668; 3, KCOM 2812; 4, C. ochracea ATCC 27872T; 5, Capnocytophaga endodontalis ChDC OS43T; 6, Capnocytophaga sputigena ATCC 33612T; 7, Capnocytophaga haemolytica ATCC 51501T; 8, Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624T; 9, Capnocytophaga granulosa ATCC 51502T. cSummed feature 3, iso-C15:0 ALDE/UN 13.570. dSummed feature 11, iso-C17:0 3OH/C18:2 DMA.

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