Journal Search Engine

ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)

International Journal of Oral Biology Vol.50 No.4 pp.138-146
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2025.50.4.138

GABA_A receptor-mediated effects of naringenin on substantia gelatinosa neurons in the medullary dorsal horn in juvenile mice

Seon Ah Park¹, Seon Hui Jang¹, Soo Joung Park¹, Dong Hyu Cho²*

, Seong Kyu Han¹*

¹Department of Oral Physiology, Institute of Oral Bioscience, School of Dentistry, Jeonbuk National University, Jeonju 54907, Republic
of Korea
²Department of Obstetrics and Gynecology, Research Institute of Clinical Medicine of Jeonbuk National University-Biomedical Research
Institute of Jeonbuk National University Hospital, Jeonbuk National University Medical School, Jeonju 54907, Republic of Korea

^*Correspondence to: Dong Hyu Cho, E-mail: obgyn2001@jbnu.ac.krhttps://orcid.org/0000-0002-1557-9575
^*Correspondence to: Seong Kyu Han, E-mail: skhan@jbnu.ac.krhttps://orcid.org/0000-0002-0420-7311

Received September 29, 2025 Review November 11, 2025 Accepted November 24, 2025

Abstract

Naringenin (5,7,4’-trihydroxyflavanone) is a natural bioflavonoid with numerous documented bioactivities in the central nervous system. The substantia gelatinosa (SG) of the trigeminal subnucleus caudalis (Vc; medullary dorsal horn) is recognized as a pivotal site for integration and modulation of orofacial nociceptive inputs. However, the potential effects of naringenin on orofacial pain responses and the contributions of GABA_A receptor modulation have not yet been examined. In this study, whole-cell patch-clamp technique was applied to evaluate the effects of naringenin on the GABA_A receptor responses on SG neurons in the Vc, and to assess potential sex-related differences. The GABA_A receptor agonist muscimol was applied alone or with naringenin on SG neurons in the Vc that were patch-clamped with high chloride pipette solution to augment GABA_A potentials. Naringenin increased both the amplitude and the area under the curve of muscimol-mediated responses in the majority (64.7%) of neurons tested (n = 17), and these effects differed by sex, suggesting that naringenin may modulate orofacial pain in a sex-dependent manner by enhancing GABA_A potentials on SG neurons in the Vc. Naringenin may thus be a promising prototype compound for developing therapeutic agents against orofacial pain.

Key Words : Naringenin , Muscimol , GABA_A receptor , Substantia gelatinosa neurons , Orofacial nociception

초록

키워드 :

This article has been cited by 0 article in crossref

Cited-By

Funding:

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Introduction

척수 감각핵 미측소핵(trigeminal subnucleus caudalis, Vc)은 수질 에 있는 핵으로, 동측 얼굴로부터 깊거나 거친 접촉(touch), 통증(pain) 및 온도(temperature)에 대한 정보를 받는다. 삼차신경(trigeminal nerve, CN V) 외에도 안면(facial, CN VII), 설인두(glossopharynageal, CN IX), 미주 신경(vagus nerves, CN X)은 각 부위에서 Vc 로 통증 정보를 전달하는 것으로 알려져 있다[1,2]. 특히 Vc의 아교질 (substantia gelatinosa, SG)은 반투명하고 젤라틴 같은 외관을 따서 Rolando에 의해 명명되었으며[3], 말초(periphery)로부터 통증정보를 받아 상행통증경로(ascending pain pathway)를 통해 상위 중추로 악 안면 통증정보를 전달하는 역할을 하고, 뇌간(brain stem)으로부터 내 려오는 하행억제성 경로(descending inhibitory pathway)에 의해 통 증정보 전달과정이 강력하게 조절된다[1,2,4]. 통증이나 온도에 대한 정보를 전달하는 C 섬유 및 빠르고 국소적인 통증 감각을 전달하는 Aδ 섬유는 SG 신경세포로 통증 정보를 수신하고 이를 상행하는 투영 신경 세포로 전달하는 것으로 알려져 있다[5]. 구강안면 부위의 통증은 얼굴 의 피부, 점막, 근육, 인대 등에 감각수용기가 풍부하게 존재하기 때문 에 빈번하고 심하게 발생한다[6,7]. 특히 삼차신경통, 악관절 장애, 비 정형 치통, 두통 등의 구강안면 통증질환은 심각한 급성 및 만성 통증을 유발하며 다양한 치료에도 불구하고 삶의 질을 저하시킬 수 있다[6]. 따 라서 구강안면 부위의 통증 질환의 기전을 규명하는 연구에서 Vc의 SG 신경세포는 핵심적인 표적 부위로 활용되고 있다.

중추신경계(central nervous system, CNS)의 주요 억제성 신경전 달물질인 gamma-aminobutyric acid (GABA)는 척수와 뇌에서 통 각 조절제로서 중요한 역할을 한다[8]. 또한 GABA는 GABA 수용체 하 위 단위의 구성에 따라 통증 전달 및 인식을 향상시키거나 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다[9,10]. GABA 수용체는19개의 하위 단위(α 1–6, β 1–3, γ 1–3, δ, ε, θ, π 및 ρ 1–3)들로 이뤄져 있으며, 대부분의 GABA_A 수용체는 2개의 alpha, 2개의 beta, 그리고 하나의 gamma 또는 delta 하위 단위들로 구성되지만, 일부 GABA_A 수용체는 rho 하위 단위들로 구성된 homo- 또는 hetero-pentamers로 형성되어 기능적 인 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다[11]. 한편 GABA_A 수용체는 뇌 발 달 과정에서 성별에 따라 그 기능이 바뀔 수 있으며, GABA에 대한 반 응의 성별 차이는 수컷과 암컷의 뇌를 구축하는 데 있어 주요 분기점이 될 수 있음이 보고되었다[12]. 이러한 성별간 GABA 반응 차이는 서로 다른 신호전달 경로를 활성화시키고, 궁극적으로 다양한 유전자 발현의 변화는 특정 뉴런의 표현형에 영향을 미칠 수 있는 것으로 확인되었다 [12].

지난 수십 년 동안 다양한 천연 화합물의 GABA-benzodiazepine 부위 결합과 신경활성 조절의 상관관계에 대한 연구결과들이 보고되었 다[13]. 주요 flavanone 중 하나인 naringenin (4′,5,7-trihydroxyflavanone) 은 자몽, 오렌지, 귤 등 감귤류 과일에 풍부하게 함유되어 있 을뿐만 아니라 체리, 토마토 등 일부 다른 과일들과 허브류, 견과류 등 다양한 식물에서 발견된다[14,15]. Naringenin은 생체이용률이 좋기 때문에 섭취 후 인간의 혈청에서 쉽게 검출된다[16]. 특히, naringenin 은 산화 손상으로부터 지질을 보호함으로써 항산화 능력을 가지고 있 다고 보고되었다[17]. 또한, naringenin은 염증 자극에 의해 나타나는 통증 유사 행동을 억제함으로써 진통 및 항염증 활성이 있는 것으로 보 고되었고, 통각수용체 조절을 통해 통증을 억제할 수 있는 것으로 알려 져 있으나[18,19], 구강안면 통증조절의 주요 부위인 SG 신경세포에서 naringenin의 GABA_A 수용체와 관련된 작용기전은 아직 보고되지 않 았다. 따라서 본 연구에서는 whole-cell patch clamp 기술을 사용하 여 미성숙 마우스의 SG 신경세포에서 성별에 따라 naringenin이 GABA A 수용체 작용제인 muscimol 반응에 미치는 효과를 조사하고 이를 통해 구강안면 통증 조절에서 naringenin과 GABA_A 수용체간 성별에 따른 통증조절 상관관계에 대해 연구하고자 하였다.

Materials and Methods

1. Experimental animals and preparation of brainstem slices

본 실험은 전북대학교 동물실험윤리위원회의 승인(JBNU 2022- 034)을 받아 진행하였다. 미성숙 Institute of Cancer Research 마우 스(출생 후 7–21일)는 12시간의 명암 주기 하에 유지하였고, 사료와 물 은 자유섭식을 할 수 있게 하였다(오전 7시에 불이 켜짐). 마우스에서 생후 3주 시점은 척수 후각 신경세포의 억제성 조절이 강화되고 시냅스 가소성이 변화하며 성체와 유사한 신경회로가 완성되는 전환점으로 알 려져 있다[20,21]. 따라서, 생후 3주 시점은 생쥐의 SG 신경세포에서 성숙의 분할 지점으로 많은 연구가 이뤄지기 때문에 본 실험에서도 이 조건에 해당하는 생후 7일에서 21일까지의 미성숙한 마우스를 사용하 였으며 본 연구를 위해 사용된 마우스는 총 18마리였다.

마우스는 10:00에서 12:00 사이에 절두 후 신속하게 뇌를 즉시 적출 하고 냉각시킨 인공뇌척수액(artificial cerebrospinal solution, ACSF) 에 빠르게 담갔다. ACSF의 조성은 다음과 같다; 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl₂, 1.2 mM MgCl₂, 11 mM D-glucose, 1.4 mM NaH₂PO₄ 및 25 mM NaHCO₃ (pH 7.3–7.4, 95% O₂ 및 5% CO₂로 포화). 적출된 뇌는 이전 연구에서 설명한 대로 절편으로 제작 하였다[22]. 뇌 절편(두께 180–200 μm)을 준비하기 위해 Vc의 부분 이 포함된 뇌간을 한천 블록에 붙인 다음 진동절편기(VT1200S; Leica Biosystem)를 사용하여 냉각된 ACSF에 담가둔 상태에서 관상면으로 절단한다. 전기생리학적 기록 전에 뇌 절편은 최소 1시간 동안 산소가 공급된 ACSF에서 회복되도록 기다렸다. 이후 모든 실험 단계는 실온에 서 수행되었다.

2. Reagents

Naringenin, muscimol, ACSF, 뇌절편 제조 용액 및 미세유리전극 용액의 구성성분은 Sigma Aldrich에서 구입하였다. 실험에 이용되는 모든 약물들은 특성 및 용해도에 따라 dimethyl sulfoxide (DMSO) 또 는 증류수에 녹였으며, 사용 직전에 0.5% 이내의 수준에서 ACSF에 희 석 후 관류하여 SG 신경세포에 적용하였다.

3. Diphenyl-1-picrylhydrazyl scavenging activity assay

Naringenin이 항산화 활성 능력을 가지고 있는지 평가하기 위하 여 Burits와 Bucar [23] 방법에 따라 diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능 분석법을 수행하였다. 본 연구에서 사용된 naringenin은 방향족 고리를 포함하며 물에 대한 용해도가 낮기 때문에, DMSO를 용매로 사용하여 500 mM 농도로 녹인 후 실험에 사용하였 다. Naringenin의 항산화 활성 능력이 농도 의존적인지 확인하기 위해 DPPH 용액 100 μL와 다양한 농도(0.01, 0.1, 1, 10, 100, 200, 300, 400, 500 mM)의 naringenin 용액 100 μL를 96-well microplate에 서 혼합하였으며 음성 대조군인 A0 well은 DMSO 100 μL와 DPPH 100 μL를 혼합하였다. Naringenin은 각 농도마다 3개의 well로 반 복 구성하였으며 37℃ 배양기에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계 (SPECTROstar Nano; BMG Labtech)를 이용하여 517 nm에서 흡 광도를 측정하였다. DPPH scavenging activity는 다음 공식을 사용하 여 계산되었다:

DPPH scavenging activity (%) = (A0 – An) / A0 × 100

A0은 DMSO와 반응한 흡광도이고, An은 naringenin의 각 농도별 흡광도이다.

4. Electrophysiological patch clamp recording

충분히 회복된 뇌절편을 기록용 챔버에 옮기고 ACSF를 분당 4–5 mL의 속도로 계속하여 관류시켰다. 뇌절편은 업라이트 현미경 (BX51W1; Olympus)하에서 관찰하였다. Vc 부위의 SG 신경세포 영 역은 관상절편의 측면 가장자리를 따라 척수 삼차로 내측에 반투명한 밴드를 형성하고 있어 육안으로 확인이 가능하였다. 미세유리전극 제조 기(P-97; Sutter Instruments Co.)를 이용하여 외경 1.5 mm, 내경 1 mm의 미세유리관(PG52151-4; WPI)을 Flaming/Brown 유형의 미세유리전극으로 제작하였고, 미세유리전극의 저항은 약 4–6 MΩ 범 위였다. 미세유리전극에 0.22 μm filter를 통해 여과된 미세유리전극 용액을 채운 후 전기생리학적 기록을 시행하였다. 미세유리전극 용액 조성은 다음과 같다; 140 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP 및 10 mM EGTA (pH 7.3, KOH로 보정). 미세유리전극을 head stage에 고정시킨 후 미세조작기를 이용 하여 세포 근처까지 접근시켰다. 미세유리전극이 세포에 접촉하기 직전 off-set 전위를 보정 후 미세유리전극에 약한 양압을 가한 채로 세포에 접촉시킨 다음 세포가 강하게 부착될 수 있도록 음압을 가하여 gigaseal을 형성하였다. 다시 약간의 음압으로 세포막을 파열시켜 wholecell mode가 만들어지면 이온통로 활성화에 따른 세포막의 전류 또는 전위 변화를 측정하기 위해 Axopatch 200B (Molecular Devices)를 전압고정 모드(voltage-clamp mode)에서 –60 mV로 전압을 고정 시킨 후 기록하거나 전류고정 모드(current-clamp mode)에서 0 pA 로 전류를 고정시킨 후 기록하였다. SG 신경세포에 muscimol 단독 적 용 시 전압 고정 모드에서는 3분, 전류 고정 모드에서는 2분간 적용하 였으며 naringenin은 muscimol 적용 전 3분간 전처리하였다. 수집 된 전기생리학적 신호들은 1 kHz low pass bessel filter로 여과하고 Digidata 1440A (Molecular Devices)를 통해 디지털 신호로 변환하 여 컴퓨터에 저장한 후 분석에 사용하였다[22].

5. Data analysis and statistics

DPPH scavenging activity 분석은 GraphPad Prism 9 (GraphPad Software)에서 분산 분석(analysis of variance; ANOVA)을 통해 분 석하였다. 전기생리학적 기록에서 muscimol에 의해 유발된 전류 및 전위의 크기는 Clampex 10.6 software (Molecular Devices)를 사 용하여 측정하였으며 naringenin 전처리 유무에 따른 muscimol 반응 의 곡선 아래 면적(area under the curve, AUC)은 GraphPad Prism 9를 사용하여 초기 변곡점과 피크 사이의 면적으로 계산되었다. 두 그 룹간 평균에 대한 비교 분석은 Origin 2018 (OriginLab Corp.)을 사 용하였으며 동일한 SG 신경세포에 약물을 적용했을 때의 평균값 비교 는 대응표본 t-검정(paired t-test), 성별간 평균값 비교는 비대응표본 t-검정(unpaired t-test)을 수행하여 분석하였다. Naringenin에 의한 muscimol 반응성 증가 또는 감소에 대한 성별 반응률은 카이제곱 검 정(chi-square test)을 이용하여 분석하였다. 모든 수치는 mean ± standard error of the mean (SEM)으로 표현하였으며 p ＜ 0.05일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였고 유의 수준은 ^*p ＜ 0.05, ^*^*p ＜ 0.01, ^*^*^*p ＜ 0.001, ^*^*^*^*p ＜ 0.0001로 정의하였다.

Results

1. Antioxidant activity of naringenin

전기생리학적 기록에 앞서, 화합물의 기능적 특성을 확인하기 위 해 우선 DPPH 라디칼 소거능 분석을 통해 항산화 활성을 평가하였다 (Fig. 1). 항산화 활성 정도는 다양한 농도의 naringenin에 의해 감소된 DPPH 생성 라디칼을 음성대조군의 DPPH 생성 라디칼 대비 백분율로 표현하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 naringenin의 항산화 활성은 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 특히 100 mM부터 500 mM의 농도에서 DPPH에 의해 생성된 자유 라디칼이 유의미하게 소 거되는 것을 확인할 수 있었다. 100 mM 이상의 naringenin은 0.01, 0.1, 1 및 10 mM 농도에 비해 라디칼 소거에 유의한 효과를 보였으며 100 mM부터 500 mM 사이의 농도에서는 라디칼 소거능에 유의한 차 이가 없었다. 따라서 본 연구에서 이용된 naringenin이 본질적으로 항 산화 활성을 보이며 SG 신경세포에서 GABA_A 수용체와 상호작용할 수 있는 분자로서의 가능성을 시사한다.

2. Effect of naringenin on the muscimol-induced currents

Naringenin이 GABA_A 수용체에 직접적으로 작용하는지 알아보고자 whole-cell patch clamp 기술을 사용하여 전압고정 모드에서 GABA A 수용체 작용제인 musimol 단독 적용 및 naringenin과 병용 적 용 시 muscimol에 의해 유발된 반응에 차이가 있는지 조사하였다(Fig. 2). Naringenin의 구조적 특성상, 물에 비해 용해도가 높은 DMSO 에 500 mM 농도의 naringenin stock 용액을 제조한 후 ACSF에 희 석해서 SG 신경세포에 관류를 통해 적용시켰을 때 1 mM 농도 이상 에서는 약한 내향성 전류가 유도 되고 DMSO의 높은 처리용량과 더불 어 naringenin이 완벽하게 용해되지 않는 문제점이 발생하였기 때문에 naringenin 전처리 시 내향성 전류가 나타나지 않는 농도인 0.5 mM를 선택하여 적용시킨 후 muscimol 유발 반응에 대한 효과를 확인하였다.

Fig. 2A 및 2D에서 확인되는 바와 같이, 고농도의 Cl^– 이온을 함유하 는 미세유리전극 용액 조건 하에서 SG 신경세포에 50 nM muscimol 을 적용하였을 때 내향성 전류가 유도되었다(n = 17). 게다가 naringenin 존재 시 muscimol에 의해 유도된 내향성 전류는 기록된 17개의 SG 신경세포 중 약 64.7% (11/17)에서 증가하였다(Fig. 2A). Muscimol 단독 적용 시 유도되는 내향성 전류를 기준으로 수치를 표준화하 고 naringenin 존재 하에서 muscimol에 의해 유도되는 내향성 전류를 상대적 수치로 계산하였을 때, muscimol 단독 처리 시의 결과와 비교 하여 naringenin이 있는 경우 muscimol에 의해 유도된 내향성 전류의 평균 상대 크기 및 AUC는 각각 1.705 ± 0.544 (n = 11; Fig. 2B) 및 2.293 ± 0.431 (n = 11; Fig. 2C)로 조사되었다. 반면 naringenin 존 재 하에서 muscimol에 의해 유도된 내향성 전류는 기록된 SG 신경세 포의 중 약 23.5% (4/17)에서 감소하였다(Fig. 2D). Muscimol 단독 처리 시의 결과와 비교하여 naringenin이 있는 경우 muscimol에 의해 유도된 내향성 전류의 평균 상대 크기 및 AUC는 각각 0.656 ± 0.105 (n = 4; Fig. 2E) 및 0.559 ± 0.111 (n = 4; Fig. 2F)로 확인되었다. 나머지 약 11.8% (2/17)에서는 naringenin 존재 하에서 muscimol에 의해 유도된 내향성 전류에 유의적인 변화가 나타나지 않았다(그림은 제시하지 않음). 이러한 결과는 Vc의 SG 신경세포에서 GABA_A 수용체 구성에 따라 naringenin이 GABA_A 수용체 활성에 미치는 영향이 다르 게 나타날 수 있음을 시사한다.

Naringenin이 GABA_A 수용체 활성에 미치는 영향에 성별간 차이 가 있는지 알아보기 위해 결과값을 성별에 따라 분류한 후 성별간 비교 분석을 수행하였다. 흥미롭게도 naringenin 존재 시 muscimol에 의 해 유도된 내향성 전류는 수컷보다 암컷에서 훨씬 강화되는 양상을 보 였다(Fig. 3). Fig. 3A에서 보여주듯이 15개의 SG 신경세포 중에서 naringenin 존재 하에서 muscimol에 의해 유도된 반응성의 크기는 수 컷(1.059 ± 0.176, n = 8)보다 암컷(1.844 ± 0.233, n = 7)에서 더 욱 뚜렷하게 증가하였으며 성별간 유의한 차이를 보였다(naringenin에 의해 muscimol 유도 내향성 전류에 유의한 변화가 나타나지 않은 암컷 및 수컷 SG 신경세포 각 1개씩은 비교 분석 시 제외하였음). 수컷의 경 우 naringenin 존재 하에서 muscimol에 의해 유발된 반응은 muscimol 단독 적용 시 대비 8개의 SG 신경세포 중 4개에서는 증가, 4개에 서는 감소하였으나 암컷에서는 7개의 SG 신경세포 모두에서 증가된 반 응이 관찰되었다(Fig. 3B). Figs. 2와 3에서 사용된 마우스는 각각 수컷 은 7마리, 암컷은 6마리가 사용되었다.

3. Effects of naringenin on the muscimol-induced membrane excitability on the SG neurons

Muscimol에 의해 유발되는 세포막 전위 변화에 대한 naringenin 의 효과를 확인하기 위해 전류고정 모드에서 muscimol 단독 적용 및 naringenin과 병용 적용 시 muscimol에 의해 유발되는 반응에 차 이가 있는지를 조사하였다. Fig. 4A에서 보여주는 바와 같이, 고농도 의 Cl^– 이온을 함유하는 미세유리전극 용액 조건 하에서 SG 신경세포 에 50 nM muscimol을 적용하였을 때 탈분극이 유발되었다(n = 6). Muscimol에 의해 유발된 탈분극의 크기는 naringenin 존재 여부에 따른 통계적 유의성이 없었으나 muscimol에 의해 유발된 탈분극의 AUC는 naringenin이 존재하는 경우 유의미한 증가를 보였다(Fig. 4B 및 4C). Muscimol 단독 처리 시의 결과와 비교하여 naringenin 존재 하에서 muscimol에 의해 유발되는 탈분극의 상대 평균 크기 및 AUC 는 각각 1.169 ± 0.141 (n = 6; Fig. 4B) 및 1.673 ± 0.199 (n = 6; Fig. 4C)로 분석되었다.

Discussion

Naringenin은 플라보노이드(flavonoid) 계열에 속하는 화합물로 C6-C3-C6의 기본 구조를 가지며 2번 탄소 위치에 벤젠 고리 결합, 4 번 탄소 위치에 케톤(–C = O)기를 가지고 있는 flavanone (2,3-dihydro- 2-phenylchromen-4-one)에 4′5,7 탄소 위치에 히드록시기 (–OH)를 가지는 화학적 구조를 이루고 있다[24,25]. 특히, naringenin 은 항산화, 항염증, 항암, 항당뇨, 대사 조절, 심혈관 보호, 항균 및 항바 이러스 등 다양한 생리활성을 갖는 것으로 보고되고 있으나[17-19] 통 증 조절 및 전달과 관련된 SG 신경세포에서의 작용 기전은 잘 알려지 지 않았다. 우리의 선행 연구에서 고농도의 naringenin (1 mM 이상) 을 SG 신경세포에 관류시켜 적용하였을 때 내향성 전류가 유도되었으 며 내향성 전류를 유도하지 않는 농도로 naringenin 전처리 시 GABA 반응성이 GABA 수용체 하위 단위 구성 및 성별에 따라 다르게 나타날 수 있음을 제시하였다[22]. 따라서, 본 연구에서는 naringenin이 SG 신경세포의 GABA_A 수용체 반응성에 미치는 영향에 대해 초점을 맞춰 naringenin 전처리 전후 muscimol에 의해 유도된 반응성을 성별에 따 라 비교하였으며 naringenin이 GABA_A 수용체에 미치는 영향이 성별 간 유의한 차이가 있음을 확인하였다.

Ríos 등[26]에 따르면 항산화 활성이 있다고 알려진 플라보노이드 계열은 GABA_A 수용체와 상호작용할 수 있다고 보고되었다. 따라서, naringenin 화합물의 기능적 특성을 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거 능 분석을 통해 항산화 활성을 평가하였다. 본 연구 결과에서 보여주듯 이 naringenin은 농도 의존적으로 자유 라디칼(free radical) 소거 활성 을 나타냈으며 특히 100 mM 이상의 농도에서 유의한 효과가 관찰되었 다. 그러나, 본 연구의 전기생리학적 기록에서는 0.5 mM naringenin 농도로 적용하였다. 이러한 차이는 두 실험 체계의 본질적 특성과 기술 적 제약의 차이에서 비롯된다. DPPH scavenging activity 분석은 세 포가 없는 화학적 반응 시스템으로, 주로 용해도와 반응성이 결과를 결 정하기 때문에 고농도 적용이 가능하다. 반면, patch clamp 실험은 살 아있는 신경세포에서 수행되므로, naringenin과 용매인 DMSO의 고 농도 처리는 세포 생존성 저해, 삼투압 불균형, 기록 안정성 저하와 같 은 문제를 야기할 수 있다. 따라서 비특이적이거나 독성 효과를 최소화 하기 위해 실제 적용 가능한 농도는 수백 μM 수준으로 제한된다. 따라 서 본 연구에서는 DPPH scavenging activity 분석 결과를 통해 naringenin이 본질적으로 항산화 활성을 지닌 분자라는 증거를 제공하며, patch clamp 실험을 통해 생리학적으로 허용 가능한 농도 범위에서 본 연구에 적용한 0.5 mM naringenin의 기능적 효과를 확인할 수 있음을 보여준다. 또한, 이러한 용해도 제한에도 불구하고 naringenin이 SG 신경세포의 이온 통로 활성에 생물학적으로 의미 있는 조절 효과를 나 타낼 수 있음을 시사한다.

GABA 수용체는 19개의 서로 다른 하위 단위(α 1–6, β 1–3, γ 1–3, δ, ε, θ, π 및 ρ 1–3)의 pool에서 조립된 5개의 하위 단위로 구성된 오 량체 복합체이다[11,27]. 가장 일반적인 GABA_A 수용체는 중앙 이온 기공 주위에 유사 대칭으로 배열된 2개의 α, 2개의 β 및 1개의 γ의 일 반 하위 단위를 갖는 5개의 하위 단위로 구성된다[11,27-30]. 특히, GABA_A 수용체 대부분은 α1, β2, γ2 하위 단위로 구성되지만, 뇌 영역 및 신경세포 유형에 따라 하위 단위들의 구성이 달라지므로 시냅스 전 달에 미치는 영향이 다르게 나타날 수 있다[31]. 다양한 화합물들이 개 별 GABA 수용체의 아형을 선택적으로 조절할 수 있으며 이러한 화합 물들은 각각 GABA_A 수용체의 알로스테릭(allosteric) 부위에 결합하 거나 GABA_A 결합 부위와 직접 상호작용함으로써 GABA_A 유도 전류 를 조절하거나 GABA_A 수용체를 직접 활성화할 수 있다고 알려져 있 다[32]. 특히, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 마취제(anesthetics), 신경스테로이드(neurosteroids), 피크로톡신(picrotoxin) 등의 화합물들은 GABA_A 수용체를 알로스테릭하게 조절할 수 있다[33]. 또 한, Muscimol은 GABA_A 수용체 작용제로 알려져 있으며 진정효과 [34,35] 또는 환각효과[36,37]를 일으킬 수 있는 화합물로 보고되었다. 앞선 많은 연구자들은 GABA_A 수용체 활성의 조절을 통해 CNS에 대한 플라보노이드(flavonoid)의 다양한 효과를 보고하였다[8,38]. 예를 들 어, 아피제닌(apigenin), 6-메틸아피제닌(6-methylapigenin), 디나 틴(dinatin), 스코프루레인(skrofulein), 시르실리놀(cirsilineol), 히스 피둘린(hispidulin) 및 naringenin과 같은 플라보노이드는 GABA_A-벤 조디아제핀 부위에 친화성을 나타내는 것으로 확인되었다[13,39-41]. 또한, 플라보노이드의 2'-하이드록실 그룹은 벤조디아제핀 결합 친화 력과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다[42-44]. 추가적으로, Yin 등[45]에 의해 발표된 연구결과와 Wang 등[46]에 의해 발표된 연구결과를 살펴 보면 SG 신경세포에서 플라보노이드 바이칼린(baicalin) 유발 반응이 GABA_A 수용체의 벤조디아제핀 부위의 활성화를 통해 매개되었음을 보 여주었다. 그러나 일부 연구에서는 케르세틴(quercetin) 및 아피제닌 (apigenin)과 같은 플라보노이드의 GABA_A 수용체에 대한 친화력이 벤 조디아제핀 부위와 무관하다는 보고도 있다[47,48]. 이러한 벤조디아 제핀 독립적 메커니즘은 Xenopus 난모세포의 α1β1γ2s GABA 하위 단위 수용체[47]와 HEK293 세포의 α1β2γ2 GABA 하위 단위 수용체 에 의해 매개되는 반응으로 보고되었다[48].

Naringenin은 혈액-뇌 관문(blood-brain barrier, BBB)을 통과하 는 투과성으로 인해 CNS에 여러가지 생물학적 영향을 미치는 감귤류 플라보노이드이다[49]. 특히 naringenin은 GABA_A 수용체에 결합하 여 항불안 효과를 보이는 것으로 알려져 있다[50]. Banerjee 등[51]에 의한 연구결과는 방사성 리간드 결합 분석을 통해 (S)naringenin, 글 라브롤(glabrol) 및 8-라반둘릴-플라바논(8-lavandulyl-flavanone) 과 같은 물질이 GABA 수용체의 벤조디아제핀 부위에 작용할 수 있다 고 보고하였다. 본 연구의 결과에서는 기록된 대부분의 신경세포에서 naringenin이 GABA_A 수용체 매개 전류와 AUC를 향상시키는 것으로 조사되었다. 다양한 플라보노이드가 GABA_A 수용체의 벤조디아제핀 결 합 부위와 상호 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 GABA_A 수 용체 활성의 강화는 naringenin이 GABA_A 수용체에 대한 알로스테릭 조절의 가능성이 있다고 해석할 수 있다. 벤조디아제핀은 수용체의 하 위 단위 구성에 따라 달라지는 GABA_A 수용체와 복잡한 상호 작용을 한 다. 예를 들어, 플루마제닐(flumazenil) 민감성 벤조디아제핀 부위에서 아형 선택적 부분 양성 알로스테릭 조절제로 알려진 6-하이드록시플라 본(6-hydroxy-flavone)은 α1 및 α5로 구성된 아형에 비해 α2 및 α3 로 구성된 아형에 대한 높은 선호도를 보였고 6,2′-디하이드록시플라 본(6,2′-dihydroxy-flavone)은 α1β3γ2, α2β3γ2 및 α5β3γ2에서 플 루마제닐 민감성 부분 역작용제 또는 음성 조절제로 특성화되었으나 α3β3γ2 수용체 하위 단위에서는 작용하지 않았다[8]. 이는 GABA_A 수 용체에 대한 양성 또는 음성 알로스테릭 조절제로서의 플라보노이드의 역할이 GABA_A 수용체의 다양한 하위 단위의 구성에 달려 있음을 시사 한다. Naringenin 외에도 테르펜 화합물인 리날룰(linalool) [52], 보르 네올(borneol) [53] 및 비페닐 화합물인 호노키올(honokiol) [54]은 Vc 의 SG 신경세포에 대한 GABA_A 수용체 매개 작용에 영향을 미칠 수 있 다는 가능성이 확인되었다.

본 연구 결과에서 흥미롭게도 naringenin은 성별에 따라 muscimol 반응에 다양한 효과를 보였다. 대부분의 기록된 암컷의 SG 신경세포의 경우, naringenin에 의해 muscimol 반응을 강화하는 반면, 수컷의 경 우 강화 효과와 억제 효과가 모두 관찰되었다. 벤조디아제핀은 GABA_A 수용체 알로스테릭 조절제로, GABA_A 수용체의 α1과 γ2 하위 단위 사 이의 틈이 결합 포켓으로 알려져 있다[55]. Ravizza 등[56]은 같은 연령 그룹의 수컷에 비해 암컷의 흑질 망상영역(substantia nigra pars reticulate regions)에서 α1 하위 단위 mRNA의 발현이 더 높다고 보고 하였다(postnatal day [PND] 15 및 PND 30). 또한, GABA_A 수용체 의 약리학적 특성, 뇌의 발현 패턴의 변화, GABA에 대한 친화력을 포 함한 생물·물리학적 특성은 GABA_A 수용체 하위 단위 구성에 의해 영 향을 받을 수 있다고 보고하였다[56]. 이러한 증거를 바탕으로, 본 연구 에서 조사된 결과들을 종합해보면 naringenin이 성별에 따라 GABA_A 수용체 작용에 강화 또는 억제 효과를 보였으며, 이는 GABA_A 수용체 하위 단위 구성에 따라 신경세포의 반응성이 달라질 수 있음을 시사한 다. 그러나 SG 신경세포 영역의 GABA_A 수용체 하위 단위의 성별에 따 른 변화에 대한 연구 결과는 보고되지 않았으며 추가 연구가 필요하다.

본 연구 결과는 GABA_A 수용체에 대한 naringenin의 반응성이 성별 에 따라 다르게 나타난다는 것을 보여주었으며, 이는 성별에 따라 통증 조절 기전이 다를 수 있음을 시사한다. 이 반응성 변화의 차이는 GABA A 수용체 하위 단위의 발현 수준에 따라 달라질 수 있다. 결론적으로, Vc의 SG 신경세포가 구강안면 통각을 조절하는 주요 영역이라는 점을 고려하면 GABA_A 수용체에 대한 naringenin의 성별 의존적 효과는 적 어도 부분적으로 구강안면 통증 조절에 기여할 수 있음을 시사한다.

Funding

This research was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (MSIT) (no. 2022R1I1A1A01066012) and National University Development Project at Jeonbuk National University in 2025.

Conflicts of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Figure

Fig. 1.

Naringenin effect of free radical scavenging activity. DPPH, diphenyl-1-picrylhydrazyl; ns, not significant.

^*^*p < 0.01; ^*^*^*p < 0.001; ^*^*^*^*p < 0.0001.

Fig. 2.

Effects of naringenin on muscimol-mediated responses of substantia gelatinosa neurons under a voltage clamp mode. (A, D) Representative current traces show the effect of naringenin on 50 nM muscimol-induced inward currents. (B, C) Histogram showing significant enhancement in mean relative amplitude and area under the curve (AUC) of muscimol-induced inward currents in the presence of 0.5 mM naringenin (n = 11). (E, F) Histogram showing significant suppression in mean relative amplitude and AUC of muscimol-induced inward currents in the presence of 0.5 mM naringenin (n = 4).

^*p < 0.05, ^*^*p < 0.01, paired t-test.

Fig. 3.

Gender-dependent effects of naringenin on muscimol-mediated responses of substantia gelatinosa neurons. (A) Histogram comparing the mean relative value of 50 nM muscimol-mediated response in the presence of naringenin according to gender (male n = 8, female n = 7, unpaired t-test). (B) Histogram showing the percentage of variegated effect of naringenin on muscimol-mediated response across (chi-squared test). Red color indicates an increase in response after treatment with naringenin compared to muscimol treatment alone. The blue color indicates a decreased response.

^*p < 0.05.

Fig. 4.

Effects of naringenin on muscimol-mediated responses of substantia gelatinosa neurons under a current clamp mode. (A) A representative current trace showing the effect of naringenin on 50 nM muscimol-induced depolarized responses. (B, C) A histogram showing the mean relative amplitude and area under the curve (AUC) respectively for the muscimol-induced depolarization in the absence and presence of 0.5 mM naringenin (n = 6). Cc, current clamp; ns, not significant.

^*^*p < 0.01, paired t-test.

Table

Reference

Bereiter DA, Hirata H, Hu JW. Trigeminal subnucleus caudalis: beyond homologies with the spinal dorsal horn. Pain 2000;88:221-4.
Tsai CM, Chiang CY, Yu XM, Sessle BJ. Involvement of trigeminal subnucleus caudalis (medullary dorsal horn) in craniofacial nociceptive reflex activity. Pain 1999;81:115-28.
Sheikh NK, Dua A. Neuroanatomy, substantia gelatinosa. StatPearls Publishing; 2023.
Martyn JAJ, Mao J, Bittner EA. Opioid tolerance in critical illness. N Engl J Med 2019;380:365-78.
Cervero F, Iggo A. The substantia gelatinosa of the spinal cord: a critical review. Brain 1980;103:717-72.
Christidis N, Al-Moraissi EA. Editorial: orofacial pain of muscular origin-from pathophysiology to treatment. Front Oral Health 2022;2:825490.
Ghurye S, McMillan R. Orofacial pain - an update on diagnosis and management. Br Dent J 2017;223:639-47.
Hanrahan JR, Chebib M, Johnston GA. Flavonoid modulation of GABAA receptors. Br J Pharmacol 2011;163:234-45.
Enna SJ, McCarson KE. The role of GABA in the mediation and perception of pain. Adv Pharmacol 2006;54:1-27.
Wang C, Hao H, He K, An Y, Pu Z, Gamper N, Zhang H, Du X. Neuropathic injury-induced plasticity of GABAergic system in peripheral sensory ganglia. Front Pharmacol 2021;12:702218.
Olsen RW, Sieghart W. International union of pharmacology. LXX. Subtypes of gamma-aminobutyric acidA receptors: classification on the basis of subunit composition, pharmacology, and function. Update. Pharmacol Rev 2008;60:243-60.
McCarthy MM, Auger AP, Perrot-Sinal TS. Getting excited about GABA and sex differences in the brain. Trends Neurosci 2002;25:307-12.
Jäger AK, Almqvist JP, Vangsøe SAK, Stafford GI, Adsersen A, Van Staden J. Compounds from Mentha aquatica with affinity to the GABA-benzodiazepine receptor. S Afr J Bot 2007;73: 518-21.
Galati G, Moridani MY, Chan TS, O'Brien PJ. Peroxidative metabolism of apigenin and naringenin versus luteolin and quercetin: glutathione oxidation and conjugation. Free Radic Biol Med 2001;30:370-82.
Hsu HT, Tseng YT, Lo YC, Wu SN. Ability of naringenin, a bioflavonoid, to activate M-type potassium current in motor neuron-like cells and to increase BKCa-channel activity in HEK293T cells transfected with α-hSlo subunit. BMC Neurosci 2014;15:135.
Palma-Duran SA, Caire-Juvera G, Robles-Burgeño Mdel R, Ortega-Vélez MI, Gutiérrez-Coronado Mde L, Almada Mdel C, Chávez-Suárez K, Campa-Siqueiros M, Grajeda-Cota P, Saucedo-Tamayo Mdel S, Valenzuela-Quintanar AI. Serum levels of phytoestrogens as biomarkers of intake in Mexican women. Int J Food Sci Nutr 2015;66:819-25.
Cavia-Saiz M, Busto MD, Pilar-Izquierdo MC, Ortega N, Perez-Mateos M, Muñiz P. Antioxidant properties, radical scavenging activity and biomolecule protection capacity of flavonoid naringenin and its glycoside naringin: a comparative study. J Sci Food Agric 2010;90:1238-44.
Straub I, Mohr F, Stab J, Konrad M, Philipp SE, Oberwinkler J, Schaefer M. Citrus fruit and fabacea secondary metabolites potently and selectively block TRPM3. Br J Pharmacol 2013; 168:1835-50.
Pinho-Ribeiro FA, Zarpelon AC, Fattori V, Manchope MF, Mizokami SS, Casagrande R, Verri WA Jr. Naringenin reduces inflammatory pain in mice. Neuropharmacology 2016;105: 508-19.
Park SA, Yang EJ, Han SK, Park SJ. Age-related changes in the effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis. Neurosci Lett 2012;510:78-81.
Fitzgerald M, Koltzenburg M. The functional development of descending inhibitory pathways in the dorsolateral funiculus of the newborn rat spinal cord. Brain Res 1986;389:261-70.
Park SA, Nguyen TTP, Park SJ, Han SK. Naringenin modulates GABA mediated response in a sexdependent manner in substantia gelatinosa neurons of trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Korean J Physiol Pharmacol 2024;28:73- 81.
Burits M, Bucar F. Antioxidant activity of Nigella sativa essential oil. Phytother Res 2000;14:323-8.
Den Hartogh DJ, Tsiani E. Antidiabetic properties of naringenin: a citrus fruit polyphenol. Biomolecules 2019;9:99.
Mir IA, Tiku AB. Chemopreventive and therapeutic potential of “naringenin,” a flavanone present in citrus fruits. Nutr Cancer 2015;67:27-42.
Ríos JL, Schinella GR, Moragrega I. Phenolics as GABAA receptor ligands: an updated review. Molecules 2022;27:1770.
Sui Y, Mortensen M, Yuan B, Nicholson MW, Smart TG, Jovanovic JN. GABAA receptors and neuroligin 2 synergize to promote synaptic adhesion and inhibitory synaptogenesis. Front Cell Neurosci 2024;18:1423471.
Jansen M, Rabe H, Strehle A, Dieler S, Debus F, Dannhardt G, Akabas MH, Lüddens H. Synthesis of GABAA receptor agonists and evaluation of their alpha-subunit selectivity and orientation in the GABA binding site. J Med Chem 2008;51: 4430-48.
Nutt DJ, Malizia AL. New insights into the role of the GABAA- benzodiazepine receptor in psychiatric disorder. Br J Psychiatry 2001;179:390-6.
Sigel E. Mapping of the benzodiazepine recognition site on GABA-A receptors. Curr Top Med Chem 2002;2:833-9.
Dixon C, Sah P, Lynch JW, Keramidas A. GABAA receptor α and γ subunits shape synaptic currents via different mechanisms. J Biol Chem 2014;289:5399-411.
Sieghart W, Savić MM. International union of basic and clinical pharmacology. CVI: GABAA receptor subtype- and functionselective ligands: key issues in translation to humans. Pharmacol Rev 2018;70:836-78.
Korpi ER, Gründer G, Lüddens H. Drug interactions at GABAA receptors. Prog Neurobiol 2002;67:113-59.
Lancel M, Crönlein TA, Faulhaber J. Role of GABAA receptors in sleep regulation. Differential effects of muscimol and midazolam on sleep in rats. Neuropsychopharmacology 1996;15: 63-74.
Nelson LE, Guo TZ, Lu J, Saper CB, Franks NP, Maze M. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat Neurosci 2002; 5:979-84.
Gilad E, Biger Y. Paralysis of convergence caused by mushroom poisoning. Am J Ophthalmol 1986;102:124-5.
Mendelson G. Letter: treatment of hallucinogenic-plant toxicity. Ann Intern Med 1976;85:126.
Youdim KA, Shukitt-Hale B, Joseph JA. Flavonoids and the brain: interactions at the blood-brain barrier and their physiological effects on the central nervous system. Free Radic Biol Med 2004;37:1683-93.
Jäger AK, Saaby L. Flavonoids and the CNS. Molecules 2011;16:1471-85.
Liu Z, Silva J, Shao AS, Liang J, Wallner M, Shao XM, Li M, Olsen RW. Flavonoid compounds isolated from Tibetan herbs, binding to GABAA receptor with anxiolytic property. J Ethnopharmacol 2021;267:113630.
Stafford GI, Jäger AK, van Staden J. Activity of traditional South African sedative and potentially CNS-acting plants in the GABA-benzodiazepine receptor assay. J Ethnopharmacol 2005;100:210-5.
Deeb O, Shaik B, Agrawal VK. Exploring QSARs of the interaction of flavonoids with GABA (A) receptor using MLR, ANN and SVM techniques. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;29: 670-6.
Wang F, Shing M, Huen Y, Tsang SY, Xue H. Neuroactive flavonoids interacting with GABAA receptor complex. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord 2005;4:575-85.
Wasowski C, Marder M. Flavonoids as GABAA receptor ligands: the whole story? J Exp Pharmacol 2012;4:9-24.
Yin H, Bhattarai JP, Oh SM, Park SJ, Ahn DK, Han SK. Baicalin activates glycine and γ-aminobutyric acid receptors on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subsnucleus caudalis in juvenile mice. Am J Chin Med 2016;44:389-400.
Wang F, Xu Z, Ren L, Tsang SY, Xue H. GABAA receptor subtype selectivity underlying selective anxiolytic effect of baicalin. Neuropharmacology 2008;55:1231-7.
Goutman JD, Waxemberg MD, Doñate-Oliver F, Pomata PE, Calvo DJ. Flavonoid modulation of ionic currents mediated by GABAA and GABAC receptors. Eur J Pharmacol 2003;461:79- 87.
Losi G, Puia G, Garzon G, de Vuono MC, Baraldi M. Apigenin modulates GABAergic and glutamatergic transmission in cultured cortical neurons. Eur J Pharmacol 2004;502:41-6.
Youdim KA, Qaiser MZ, Begley DJ, Rice-Evans CA, Abbott NJ. Flavonoid permeability across an in situ model of the blood-brain barrier. Free Radic Biol Med 2004;36:592-604.
Medina JH, Viola H, Wolfman C, Marder M, Wasowski C, Calvo D, Paladini AC. Neuroactive flavonoids: new ligands for the benzodiazepine receptors. Phytomedicine 1998;5:235-43.
Banerjee S, Manisha C, Murugan D, Justin A. Natural products altering GABAergic transmission. In: A. El-Shemy H, editor. Natural Medicinal Plants. IntechOpen; 2022.
Phuong TNT, Jang SH, Rijal S, Jung WK, Kim J, Park SJ, Han SK. GABA- and glycine-mimetic responses of linalool on the substantia gelatinosa of the trigeminal subnucleus caudalis in juvenile mice: pain management through linalool-mediated inhibitory neurotransmission. Am J Chin Med 2021;49:1437- 48.
Nguyen PTT, Jang SH, Rijal S, Park SJ, Han SK. Inhibitory actions of borneol on the substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in mice. Korean J Physiol Pharmacol 2020;24:433-40.
Le HTN, Rijal S, Jang SH, Park SA, Park SJ, Jung W, Han SK. Inhibitory effects of honokiol on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in juvenile mice. Neuroscience 2023;521:89-101.
Sigel E, Lüscher BP. A closer look at the high affinity benzodiazepine binding site on GABAA receptors. Curr Top Med Chem 2011;11:241-6.
Ravizza T, Friedman LK, Moshé SL, Velísková J. Sex differences in GABAAergic system in rat substantia nigra pars reticulata. Int J Dev Neurosci 2003;21:245-54.

GABAA receptor-mediated effects of naringenin on substantia gelatinosa neurons in the medullary dorsal horn in juvenile mice