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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)
International Journal of Oral Biology Vol.51 No.1 pp.1-8
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2026.51.1.1

Cooperative promotion of epithelial-mesenchymal transition by TGF-β1 and EGF co-stimulation in oral squamous cell carcinoma cells

Bo Ram Keum1, Soon Chul Heo1,2, Hyung Joon Kim1*
1Department of Oral Physiology, Dental and Life Science Institute, School of Dentistry, Pusan National University, Yangsan 50612, Republic of Korea
2Institute of Tissue Regeneration Engineering (ITREN), Mechanobiology Dental Medicine Research Center, Dankook University, Cheonan 31116, Republic of Korea
*Correspondence to: Hyung Joon Kim, hjoonkim@pusan.ac.krhttps://orcid.org/0000-0002-2962-9553
January 30, 2026 February 25, 2026 March 3, 2026

Abstract


Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a critical process that drives tumor invasion and metastasis in oral squamous cell carcinoma (OSCC). Although transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) and epidermal growth factor (EGF) are well-established inducers of EMT, the signaling crosstalk underlying their combined effects during the initial phase remains poorly defined. This study investigated the impact of combined TGF-β1 and EGF stimulation on EMTrelated phenotypic and molecular changes in HSC-3 OSCC cells. The cells were treated with TGF-β1 (10 ng/mL) and EGF (100 ng/mL), either individually or in combination. Cell proliferation, morphological changes, EMT marker expression, signaling pathway activation, and migratory capacity were assessed using cell counting kit-8 assays, quantitative morphological analysis, RT-qPCR, immunoblotting, and wound healing assays, respectively. Although TGF-β1 or EGF alone induced partial EMT-like changes, combined stimulation produced a pronounced spindleshaped morphology, an increased cell aspect ratio, and loss of epithelial cell-cell contact. Consistently, cotreatment led to greater repression of E-cadherin and enhanced upregulation of N-cadherin and Vimentin compared with single treatments. Notably, dual exposure markedly increased Smad2 and extracellular signal-regulated kinase (ERK) phosphorylation while accelerating cell migration. These findings indicate that TGF-β1 and EGF cooperatively promote EMT and migratory behavior through the coordinated activation of Smad2 and MAPK/ERK signaling pathways, highlighting this crosstalk as a potential therapeutic target for OSCC metastasis.


Oral squamous cell carcinoma , Epithelial-mesenchymal transition , Transforming growth factor beta , Epidermal growth factor , Cell migration

초록

    © The Korean Academy of Oral Biology. All rights reserved.

    This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

    Introduction

    두경부 편평상피세포암(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)은 전 세계적으로 발생률 7위를 차지하는 악성종양으로, 전체 암 사망의 약 4.6%를 차지한다[1,2]. HNSCC의 아형 중 구강 점막 상피에서 발생하는 구강 편평상피세포암(oral squamous cell carcinoma, OSCC)은 특히 임상적으로 어려운 문제들을 가지고 있다. OSCC 전체 5년 생존율은 50% 이상이지만, 전이성 질환이 발생한 환자에서는 50% 미만으로 급격히 감소한다[2]. 이러한 생존율의 현저한 저하는 OSCC 전이의 분자 기전을 이해하고 이를 예방하거나 역전시킬 수 있는 치료 표적을 발굴하는 것이 매우 중요함을 시사한다.

    전이는 암세포가 원발 종양에서 림프계 또는 혈류를 통해 다른 장기로 확산되는 과정으로, 암 관련 사망의 주요 원인이다. 전이를 촉진하는 중요한 분자 기전 중 하나는 상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition, EMT)로, 상피세포가 세포-세포 접착을 상실하고 중간엽 특성을 획득하며 향상된 이동 및 침윤 능력을 갖게 되는 현상을 의미한다[3,4]. EMT 과정에서 암세포는 상피 표지자(epithelial marker)인 E-cadherin의 발현 감소와 중간엽 표지자(mesenchymal marker)인 N-cadherin 및 Vimentin의 발현 증가로 특징지어지는 표현형 변화를 가진다. 이러한 분자적 변화는 Snail, Twist, ZEB1과 같은 EMT 유도 전사인자(EMT-inducing transcription factors, EMT-TFs)에 의해 조율되며, 이들은 유전자 발현을 재프로그래밍하여 전이 과정을 촉진하는 것으로 알려져 있다[4-6].

    암세포에서 EMT의 유도는 종양 미세환경에 존재하는 다양한 성장인자에 의해 변화되며, 그 중에서도 transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), epidermal growth factor (EGF)가 특히 중요하다[5,6]. TGF-β1은 주로 표준 Smad 의존적 경로를 통해 EMT를 활성화하지만, 수용체에 결합하면 Smad2/3 인산화, Smad4와의 복합체 형성, 그리고 핵으로 이동을 통해 EMT-TFs 발현을 활성화한다[4,5]. 이러한 경로 외에도 TGF-β1은 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 및 phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/AKT)를 포함한 비-Smad 경로를 동시에 활성화하여 세포골격 재조직, 세포 형태 변화, 운동성 향상을 조절한다[6]. 유사하게, EGF는 상피 성장인자 수용체(EGF receptor, EGFR)를 통한 신호전달로 MAPK/extracellular signal-regulated kinase (ERK) 및 PI3K/AKT 경로를 포함한 하위 신호전달 경로를 활성화하여 EMT-TF의 발현 증가를 유도하고, 이후 중간엽 특성 및 침윤성 기능을 촉진할 수 있음이 보고된 바 있다[7,8].

    최근 연구에서 TGF-β1과 EGF 신호전달 경로가 독립적으로 작동하지 않고 광범위한 교차작용을 통해 EMT 반응을 상승적으로 증폭시킬 수 있음이 보고되었다[9]. 여러 경로 간 상호작용 메커니즘으로 TGF-β1은 EGFR 발현을 상향조절하고 ERK 활성을 지속시켜 EGF 매개 반응을 증폭시키는 것으로 알려져 있으며[10,11], EGF 신호전달은 Smad2/3을 활성화시켜 세포를 TGF-β1 자극에 민감하게 만든다[12,13]. 또한, 두 경로 모두 ERK, AKT 등 다양한 EMT-TF와 같은 공통 하위 신호분자를 활성화하므로, 동시 자극 시 개별 반응보다 큰 효과를 나타낼 수 있다. 종양 미세환경에는 일반적으로 여러 성장인자가 동시에 작용하므로, TGF-β1과 EGF의 혼합 자극이 EMT에 미치는 영향을 이해하는 것은 생체 내(in vivo)에서 작동하는 복잡한 신호전달 네트워크를 보다 정확하게 재현할 수 있다.

    2011년 Richter 등[6]은 장기간의 공동 자극이 OSCC 세포에서 Laminin-332의 발현과 함께 완전한 EMT 표현형을 유도함을 보고한 바 있다. 그러나, 고전이성 특징을 가진 human tongue squamous carcinoma cell line (HSC-3) 세포에서 초기 동안 두 인자가 어떻게 신호전달 수준에서 통합되어 초기 EMT를 촉발하는지에 대한 구체적인 기전은 여전히 명확하지 않다. 현재까지의 대부분 연구는 이러한 성장인자를 개별적으로 조사하였으므로, 경로 교차작용 및 신호 통합이 EMT 발현, 표현형 결과를 어떻게 조절하는지에 대한 이해가 부족한 실정이다. 구체적으로, 혼합 자극이 EMT 마커 발현에 가산효과(additive effect) 또는 상승 효과(synergistic effect)를 생성하는지, 경로 간 상호작용으로부터 고유한 신호전달 특성이 나타나는지, 그리고 이러한 분자적 변화가 OSCC 세포의 이동 및 침윤 행동의 향상으로 어떻게 전환되는지는 여전히 불명확하다.

    따라서 본 연구에서는 림프절 전이 유래의 고전이성 OSCC 세포주인 HSC-3에서 TGF-β1과 EGF의 단독 및 혼합 처리가 EMT 유도에 미치는 영향을 체계적으로 확인하였다. 특히 Smad2와 ERK 신호전달 경로의 교차 활성화 기전을 규명함으로써, OSCC의 전이 과정에 대한 이해를 높이고 새로운 치료 전략 개발의 기초 자료를 제공하고자 한다.

    Materials and Methods

    1. Reagent

    본 실험에 사용한 HSC-3는 부산대학교 치의학전문대학원 구강병리학교실 유미현 교수님에게 제공받아 사용하였다. 세포 배양에 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Cytiva), fetal bovine serum (FBS; Gibco), 1×penicillin-streptomycin (1×P/S; Gibco), Dulbecco’s phosphate buffered saline (Welgene), 0.05% trypsin/EDTA (Gibco)를 사용하였고, TGF-β1, EGF는 PeproTech에서 구매하여 사용하였다.

    2. Cell culture

    HSC-3 세포 배양은 10% FBS, 1×P/S가 첨가된 DMEM 배지를 사용하였으며 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포를 분주한 후 24시간 배양한 뒤, 10 ng/mL TGF-β1, 100 ng/mL EGF 단독 및 혼합 처리하여 실험에 사용하였다.

    3. Cell morphology assay

    세포를 1 × 103 cells/well로 분주한 후 TGF-β1, EGF 단독 및 혼합 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 현미경을 이용하여 세포 형태 변화를 관찰하였다. 세포 형태 변화는 ImageJ software (National Institutes of Health)를 이용하여 종횡비를 정량적으로 분석하였다.

    4. Cell proliferation

    세포 증식률은 cell counting kit-8 (CCK-8; DOJINDO)를 제조사의 지시에 따라 이용하여 관찰하였다. 96 well plate에 2 × 103 cells/well 분주한 후 24시간 뒤 TGF-β1, EGF 단독 및 혼합 처리하여 배양하였다. 시간 경과(0, 24, 48시간)에 따라 CCK-8 용액을 첨가한 후, ELISA reader (Opsys MR Microplate Reader; Dynex Technologies)를 이용하여 optical density 450 nm에서 측정하였다[14].

    세포 증식률은 cell counting kit-8 (CCK-8; DOJINDO)를 제조사의 지시에 따라 이용하여 관찰하였다. 96 well plate에 2 × 103 cells/well 분주한 후 24시간 뒤 TGF-β1, EGF 단독 및 혼합 처리하여 배양하였다. 시간 경과(0, 24, 48시간)에 따라 CCK-8 용액을 첨가한 후, ELISA reader (Opsys MR Microplate Reader; Dynex Technologies)를 이용하여 optical density 450 nm에서 측정하였다.

    5. Real-time quantitative polymerase chain reaction

    EMT 표지자 mRNA 발현 수준을 분석하기 위해 real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)을 수행하였다. 실험에 사용한 RNA는 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 각 dNTP Mix, Oligo (dT) primer, Maxima H Minus Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific)를 혼합하여 cDNA로 합성하였다. 합성한 cDNA, SYBR Green qPCR Kit (Enzynomics), primer를 혼합한 후, AB 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 이용하여 분석하였다. 본 실험에 사용한 primer는 Table 1에 표기하였으며, Housekeeping gene으로 ACTB를 사용하였다.

    6. Immunoblotting

    EMT 표지자 및 신호전달 단백질의 발현을 확인하기 위해, immunoblotting을 수행하였다. Protein lysis buffer (TransLab)를 이용하여 추출한 후, BCA assay (Thermo Fisher Scientific)로 정량하여 사용하였다. 10% Sodium dodecyl sulfate-polyarylamide gel 전기영동 후, nitrocellulose membrane (Cytiva)으로 transfer하였다. 5% Skim milk로 상온에서 1시간 blocking하였다. 1차 항체 E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, Actin, phospho-Smad2, Smad2, phospho-ERK, ERK (Cell Signaling Technology)를 첨가한 후 4°C에서 shaking하여 24시간 반응시켰다. 1×Tris buffered saline with tween20로 세척한 후 2차 항체 anti-rabbit 및 anti-mouse (Enzo Life Sciences)를 상온에서 1시간 반응시켰다. Enhanced chemiluminescence detection system (Thermo Fisher Scientific)을 처리한 후 LAS (Azure 600)를 이용하여 단백질을 현상하였다.

    EMT 표지자 및 신호전달 단백질의 발현을 확인하기 위해, immunoblotting을 수행하였다. Protein lysis buffer (TransLab)를 이용하여 추출한 후, BCA assay (Thermo Fisher Scientific)로 정량하여 사용하였다. 10% Sodium dodecyl sulfate-polyarylamide gel 전기영동 후, nitrocellulose membrane (Cytiva)으로 transfer하였다. 5% Skim milk로 상온에서 1시간 blocking하였다. 1차 항체 E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, Actin, phospho-Smad2, Smad2, phospho-ERK, ERK (Cell Signaling Technology)를 첨가한 후 4℃에서 shaking하여 24시간 반응시켰다. 1×Tris buffered saline with tween20로 세척한 후 2차 항체 anti-rabbit 및 anti-mouse (Enzo Life Sciences)를 상온에서 1시간 반응시켰다. Enhanced chemiluminescence detection system (Thermo Fisher Scientific)을 처리한 후 LAS (Azure 600)를 이용하여 단백질을 현상하였다.

    7. Wound healing assay

    HSC-3 세포 포화도가 100% 도달한 후, 6시간 동안 FBS가 첨가되지 않은 배지를 처리하여 6시간 FBS starvation하였다. 200 μL pipette tip을 이용하여 scratch를 만든 다음 시약 처리하여 배양하였다. 시간별로 촬영하였으며, crystal violet (DUKSAN)으로 세포를 염색하여 확인하였다. 세포간 거리는 ImageJ를 이용하여 측정한 후 수치화하였다.

    HSC-3 세포 포화도가 100% 도달한 후, 6시간 동안 FBS가 첨가되지 않은 배지를 처리하여 6시간 FBS starvation하였다. 200 μL pipette tip을 이용하여 scratch를 만든 다음 시약 처리하여 배양하였다. 시간별로 촬영하였으며, crystal violet (DUKSAN)으로 세포를 염색하여 확인하였다. 세포간 거리는 ImageJ를 이용하여 측정한 후 수치화하였다[15].

    8. Statistical analysis

    본 실험 결과는 mean ± standard error of the mean으로 나타내었으며, 각 실험군의 유의성 검정은 GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 분석하였다. 두 그룹 간 비교는 Student's t-test를 사용하였으며, 세 개 이상의 그룹간 비교는 일원(one-way) 또는 이원(two-way) 분산분석(analysis of variance)을 실시한 후, 사후분석 Tukey's post hoc test로 유의성을 검증하였다. p < 0.05일 경우, 통계적 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다.

    Results

    1. Effects of TGF-β1 and EGF co-stimulation on cell proliferation and morphology

    TGF-β1 및 EGF가 OSCC 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, HSC-3 세포를 TGF-β1, EGF 단독 또는 혼합 처리하여 세포 증식과 형태 변화를 분석하였다. 성장인자 처리에 따른 세포 형태를 확인하였을 시 뚜렷하게 변화된 것을 관찰하였다(Fig. 1A). 대조군 세포는 세포간 접촉이 유지된 전형적인 상피세포 형태를 보였으나, TGF-β1 또는 EGF 단독 처리군에서는 세포 신장과 세포간 접촉 감소가 부분적으로 관찰되었다. 특히, TGF-β1과 EGF를 혼합 처리한 군에서는 방추형의 섬유아세포 유사 형태와 함께 세포간 접촉 소실 및 세포질 돌기 증가가 뚜렷하게 나타났다. 이러한 형태 변화를 정량적으로 분석하기 위해 종횡비를 측정한 결과, TGF-β1, EGF 혼합 처리군에서 대조군, TGF-β1, EGF 단독 처리군에 비해 유의하게 증가하였다(Fig. 1B). Cell proliferation을 분석한 결과 24시간 시점에서는 모든 처리군 간 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 반면, 48시간 시점에서는 TGF-β1과 EGF를 혼합 처리한 군에서 대조군 및 단독 처리군에 비해 세포 증식이 유의하게 증가하였다(Fig. 1C). 이러한 결과를 토대로 TGF-β1과 EGF의 혼합 처리가 HSC-3 세포에서 EMT와 연관된 형태 변화를 효과적으로 유도함을 확인하였다.

    2. Regulation of EMT marker expression by TGF-β1 and EGF co-stimulation

    성장인자에 의해 유도된 형태 변화가 EMT 관련 분자 변화와 연관되는지를 확인하기 위하여, 상피 표지자 CDH1 (E-cadherin)과 중간엽 표지자 CDH2 (N-cadherin) 및 Vimentin (Vimentin)의 mRNA 및 단백질 발현을 분석하였다. RT-qPCR을 분석하였을 시, TGF-β1과 EGF를 혼합 처리군에서 CDH1 mRNA 발현이 대조군 대비 가장 크게 감소하였다. 이는 TGF-β1 및 EGF 단독 처리군에 비해 유의하게 낮은 수준이었다. 반대로 CDH2 및 Vimentin mRNA 발현은 TGF-β1 단독 처리군에서 가장 크게 증가하였고, TGF-β1, EGF 혼합 처리군에서도 유의한 증가가 관찰되었으나 그 수준은 TGF-β1 단독 처리군과 유사하거나 다소 낮은 경향을 보였다(Fig. 2A). 단백질 분석 결과에서도 mRNA 발현 변화와 유사한 단백질 발현 양상을 확인하였다(Fig. 2B). E-cadherin 단백질 발현은 TGF-β1, EGF 혼합 처리군에서 대조군 대비 유의하게 감소하였으며, 이는 단독 처리군보다 낮은 수준이었다. 반면, N-cadherin과 Vimentin 단백질 발현은 TGF-β1 단독 및 TGF-β1, EGF 혼합 처리군에서 증가하였다. 이러한 결과는 TGF-β1이 EMT 유도의 주요 인자로 작용하며, EGF와의 혼합 처리는 특히 CDH1 (E-cadherin) 억제를 강화함으로써 EMT 표현형을 더욱 촉진할 수 있음을 보여준다.

    3. Enhanced cell migration induced by TGF-β1 and EGF

    TGF-β1, EGF 및 혼합 처리에 의한 EMT 변화가 세포 이동에도 영향을 미치는지 확인하기 위해, wound healing assay를 수행하였다. Scratch 형성 후 12시간 시점에서 대조군에서도 scratch 간격이 일정 수준 감소된 것이 관찰되었으나 TGF-β1 및 EGF 단독 처리군에서는 통계적으로 유의한 이동성 증가를 확인하였다. 특히 TGF-β1, EGF 혼합 처리군은 단독 처리군보다 더 높은 scratch 폐쇄율을 나타내었다(Fig. 3). 이러한 결과는 TGF-β1과 EGF 혼합 처리가 OSCC 세포의 이동성을 효과적으로 증가시킬 수 있음을 시사한다.

    4. Activation of EMT-related signaling pathways by TGF-β1 and EGF

    TGF-β1과 EGF에 의한 EMT 유도의 분자적 기전을 규명하기 위하여, 성장인자 처리 후 Smad2 및 MAPK/ERK 신호전달 경로 활성을 분석하였다(Fig. 4). TGF-β1 단독 처리 시 Smad2 인산화가 유도되었으며, 흥미롭게도 EGF가 포함된 혼합 처리군에서는 이러한 Smad2 인산화가 단독 처리군보다 더욱 강하게 증가하여 나타났다. MAPK/ERK 경로 분석 결과에서도 TGF-β1과 EGF 혼합 처리군에서 ERK 인산화가 증가하는 것을 확인하였다. 이는 TGF-β1과 EGF 혼합 처리가 Smad2와 ERK 경로 간의 긍정적 피드백이나 상호 보완작용을 통해 신호 활성을 증폭시킴으로써 EMT 효능을 극대화함을 시사한다.

    Discussion

    본 연구에서는 TGF-β1과 EGF의 단독처리 및 혼합 처리가 OSCC 세포에서 EMT 유도와 세포 이동성에 미치는 영향을 체계적으로 분석하였다. TGF-β1 (10 ng/mL) 및 EGF (100 ng/mL)는 OSCC 모델 내 EMT 유도를 위해 선행 연구들이 채택한 범위를 근거로 하였다[4-6]. 그 결과, TGF-β1과 EGF의 혼합 자극은 단독 처리에 비해 HSC-3 세포의 형태 변화와 EMT 관련 분자 발현을 보다 뚜렷하게 유도하였으며, 세포 이동성 증가와 관련 신호전달 경로 활성화가 동반됨을 확인하였다. 이러한 결과는 OSCC 전이 과정에서 다중 성장인자 신호가 통합적으로 작용할 가능성을 보여준다.

    EMT는 상피세포가 세포 간 접착을 상실하고 중간엽성 특성을 획득하는 과정으로, 암의 침윤 및 전이에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다[16,17]. 본 연구에서 관찰된 방추형 형태로의 전환, 세포 간 접촉 감소 및 종횡비 증가는 EMT와 연관된 대표적인 형태학적 특징에 해당된다. 특히, 이러한 변화가 TGF-β1과 EGF의 혼합 처리군에서 가장 뚜렷하게 나타났다는 점은, 실제 종양 미세환경과 같이 다양한 사이토카인이 혼재된 상황에서 암세포가 더 공격적인 표현형을 획득할 수 있음을 시사한다[18]. 분자적 분석 결과에서도 이러한 형태학적 변화와 일관된 경향이 확인되었다. TGF-β1과 EGF의 혼합 자극은 상피 표지자인 E-cadherin 발현을 현저히 감소시키는 동시에, 중간엽 표지자인 N-cadherin과 Vimentin의 발현을 증가시켰다. 다만, 일부 중간엽 표지자의 경우 TGF-β1 단독 처리와 유사한 수준의 증가를 나타내어, 혼합 자극이 모든 EMT 지표에서 단순합 이상의 효과를 보인 것은 아니었다. 이러한 cadherin switch는 EMT의 핵심 분자적 특징으로, 세포 이동성 및 침윤성 증가와 밀접하게 연관되어 있음이 보고되어 있다[19,20]. 본 연구에서 수행한 wound healing assay 결과, 특히 12시간 시점에서 관찰된 scratch 영역의 유의한 감소는 EMT 관련 분자 변화가 실제 이동성 증가로 연결됨을 입증한다[21,22].

    혼합 처리군에서 나타난 48시간 CCK-8 신호 증가는 강력한 EGFR 활성화에 따른 mitogenic 반응 및 대사적 보상이 반영된 것으로 판단된다. 이러한 생존 신호의 강화는 EMT 과정 중 발생하는 anoikis (부착 이탈 사멸)에 대한 저항성을 제공함으로써, OSCC 세포의 전이 잠재력을 뒷받침하는 중요한 보조 요인이 될 수 있다[8,23].

    본 연구의 가장 중요한 발견은 두 성장인자 간의 신호전달 경로의 동시 활성화 가능성이다. TGF-β1은 Smad2 인산화를 통해 EMT를 유도하는 대표적인 인자이며[24], 본 연구에서도 TGF-β1 단독 처리 시 Smad2 인산화가 유도되었다. 주목할 점은 EGF를 병합 처리했을 때 p-Smad2의 수준이 TGF-β1 단독 처리 시보다 현저히 증가하는 양상을 보였다. 이는 EGF에 의해 활성화된 하위 신호(ERK 등)가 TGF-β 수용체의 안정성을 높이거나, Smad 단백질의 활성화를 돕는 보조적 역할을 수행했음을 시사한다[25,26]. 기존 연구들에서 MAPK/ERK 경로가 Smad의 링커 부위를 인산화하여 핵 이동을 조절하거나 전사 활성을 돕는다는 보고와 일맥상통한다[12].

    또한, 혼합 처리군에서 ERK의 인산화 역시 증가하는 경향을 보였다. ERK 경로는 EMT 유지, 세포 이동성 증가 그리고 세포 생존 신호 강화와 밀접하게 연관되어 있다[23,27]. 따라서, HSC-3 세포에서 관찰된 강력한 EMT와 이동능 증가는 TGF-β/Smad 경로와 EGF/ERK 경로가 동시에 활성화되는 신호 환경과 연관될 가능성이 있다. 이는 단일 경로 억제제가 임상에서 제한적인 효과를 보이는 이유를 설명하며, 두 경로를 동시에 차단하는 병용 요법의 필요성을 뒷받침한다.

    본 연구는 HSC-3 단일 세포주를 이용한 in vitro 실험이라는 한계가 있어, 향후 다양한 구강암 세포주 및 동물 모델(in vivo)을 이용한 검증이 필요하다. 또한 본 연구는 신호전달 활성화 양상을 관찰한 것으로, 신호 전달 억제제를 이용한 역전(reversal) 실험을 통해 각 경로의 인과관계를 보다 명확히 규명하는 후속 연구가 요구된다. 그럼에도 불구하고, 본 연구는 고전이성 구강암 세포에서 TGF-β1과 EGF가 초기 신호전달의 통합을 통해 EMT를 가속화한다는 분자적 증거를 제시했다는 점에서 의의가 있다.

    Funding

    This work was supported by a 2-Year Research Grant of Pusan National University.

    Conflicts of Interest

    No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

    Figure

    IJOB-51-1-1_F1.jpg

    Morphological changes and proliferation of HSC-3 cells upon TGF-β1 and/or EGF stimulation. (A) Phase-contrast images showing morphological changes of HSC-3 cells after treatment with TGF-β1 (10 ng/mL), EGF (100 ng/mL), or their combination (10 ng/mL TGF-β1 + 100 ng/mL EGF) for 48 hours. Scale bar = 100 µm. (B) Quantification of cell aspect ratio (length/width) under each condition. (C) Cell proliferation assay measured at 0, 24, and 48 hours post-treatment. Data represent mean ± SEM. HSC-3, human tongue squamous carcinoma cell line; TGF-β1, transforming growth factor beta 1; EGF, epidermal growth factor; SEM, standard error of the mean; OD, optical density. *p < 0.05, ***p < 0.001 compared with the control group; $$p < 0.01 compared with the EGF-treated group.

    IJOB-51-1-1_F2.jpg

    EMT marker expression in HSC-3 cells upon TGF-β1 and/or EGF treatment. (A) Relative mRNA expression levels of CDH1 (E-cadherin), CDH2 (N-cadherin), and Vimentin (Vimentin) measured by qPCR. ACTB was used as the internal control. (B) Protein expression of the same markers evaluated by Western blot. β-Actin was used as the loading control. Data represent mean ± SEM. EMT, epithelial-mesenchymal transition; HSC-3, human tongue squamous carcinoma cell line; TGF-β1, transforming growth factor beta 1; EGF, epidermal growth factor; qPCR, quantitative polymerase chain reaction; SEM, standard error of the mean. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 compared with the control group; ##p < 0.01, ###p < 0.001 compared with the TGF-β1 group; $p < 0.05, $$$p < 0.001 compared with the EGF-treated group.

    IJOB-51-1-1_F3.jpg

    Migratory capacity of HSC-3 cells in response to TGF-β1 and/or EGF stimulation. (A) Representative images of scratch wounds at 0 and 12 hours after treatment with TGF-β1 (10 ng/mL), EGF (100 ng/mL), or their combination. Scratch wounds were stained with 0.5% crystal violet solution, and representative images were captured at 0 and 12 hours. Scale bar = 200 µm. (B) Quantitative analysis of wound closure percentage over time, based on wound healing assay. Data represent mean ± SEM. HSC-3, human tongue squamous carcinoma cell line; TGF-β1, transforming growth factor beta 1; EGF, epidermal growth factor; SEM, standard error of the mean. *p < 0.05, ***p < 0.001 compared with the control group; #p < 0.05 compared with the TGF-β1 group.

    IJOB-51-1-1_F4.jpg

    Phosphorylation of Smad2 and ERK pathways in HSC-3 cells. (A) Western blot analysis showing phosphorylation of Smad2 and ERK1/2 after treatment with TGF-β1 (10 ng/mL), EGF (100 ng/mL), or their combination for 30 minutes. (B) Densitometric quantification of p-Smad2/Smad2 ratio. (C) Densitometric quantification of p-ERK/ERK ratio. Data represent mean ± SEM. ERK, extracellular signal-regulated kinase; HSC-3, human tongue squamous carcinoma cell line; TGF-β1, transforming growth factor beta 1; EGF, epidermal growth factor; SEM, standard error of the mean. ***p < 0.001 compared with the control group; ##p < 0.01, ###p < 0.001 compared with the TGF-β1 group; $$p < 0.01, $$$p < 0.001 compared with the EGF-treated group.

    Table

    Primers

    Reference

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